材料和试剂

Eppendorf管
移液器吸头
样品瓶
塑料瓶
50毫升Falcon管
带有清洁盖子的培养皿（Fisher Scientific，Fisherbrand，目录号：FB0875712）
6孔板，Corning Costar超低附着物（Corning，目录号：3471）
15ml Falcon管（Corning，Falcon ，目录号：352196）
70微米细胞过滤器（细胞过滤器 - Corning，Falcon ，目录号：352350）
冰
塑料移液器
24孔板，康宁Costar超低附着物（Corning，目录号：3473）
6孔板（康宁，目录号：3506）
血清移液器
手术刀片（FisherBrand高精度＃22型刀片刀片，Fisher Scientific，Fisherbrand TM TM，目录号：12-000-161）
无菌移液管（10ml）（FisherBrand Sterile Disposable Standard Serological Pipets，Fisher Scientific，Fisherbrand TM，目录号：13-678-14A）
冷冻管（一般长期储存低温管1 ml，Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：5000-1012）
（可选）Mission pLKO.1-puro-CMV-TurboGFP阳性对照转导颗粒（Sigma-Aldrich，目录号：SHC003V）
EDTA（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15575-020）
PBS pH 7.4（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10010023）
胰蛋白酶EDTA（0.05％）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25300054）
SureEntry转导试剂（QIAGEN，目录号：336921）
Clorox Bleach（Veritiv，目录号：30966）
肝素钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：H3149-10KU）
DMEM / F12，Glutamax（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10565018）
青霉素/链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15070063）
胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：26140079）
B27补充剂50x（无血清）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：17504044）
bFGF-人成纤维细胞生长因子147碱性（无动物）（Gemini生物产品，目录号：300-805P）
EGF-表皮生长因子（人）（Gemini Bio-Products，目录号：300-110P）
ROCK抑制剂（Y-27632）（STEMCELL Technologies，目录号：72304）
肝素溶液（STEMCELL Technologies，目录号：07980）
BD基质胶基质生长因子减少（BD Biosciences，目录号：356230）或Cultrex 3-D培养基TM减少生长因子基底膜提取物（Trevigen，目录号： 3445-001-01）
备注：
1. 将Matrigel或Cultrex基质等分成无菌罩中的一次性等分试样到无菌Eppendorf管中。我们建议每个Eppendorf管0.5 ml Matrigel。当与1.5毫升冰冷培养基结合使用时，这个量足以在一个六孔板中使用一个孔进行3D培养。
2. 使用冷冻移液器并在操作过程中将Eppendorf管置于冰上。
3. 在-80°C下保存。在冰上或冰箱里解冻后使用
休眠介质（Hibernate TM -A，Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：A1247501）
胶原酶IV（Sigma-Aldrich，目录号：C8051-100MG或类似物）
台盼蓝（TC-10，Bio-Rad Laboratories，目录号：1450013）
抗生素 - 抗真菌药（100x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15240096）
Dispase（1U / ml，STEMCELL Technologies，目录号：07923）
EDTA（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15575020）
Accutase（STEMCELL Technologies，目录号：07920）
DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：D2438-50ML）
乙醇（70％溶液，Fisher Scientific，Fisher BioReagents TM，目录号：BP8201500）
培养基（见食谱）
CSC中等（见食谱）

设备

离心机（温控型，VWR台式通用离心机）（VWR，目录号：10830-764）
移液器
镊子
CO 2细胞培养箱（BINDER，型号：CB 160）
生物安全级别（BSL-2）层流罩（Esco，EscoTechnologies，USA）
TC20自动细胞计数器（Bio-Rad）
Frosty冷冻容器先生（赛默飞世尔科技Thermo Scientific TM，产品目录号：5100-0001）
Forma TM 7000系列超低温冷冻机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：TFM＃902系列）
液氮储罐
Nikon TE-2000E运行Nikon Elements软件的D-Eclipse Csi共聚焦显微镜（尼康，型号：Eclipse TE2000-E）

软件

尼康显微镜操作软件
ImageJ或类似的图像处理软件（ https://imagej.nih.gov/ij/ ） />
美国GraphPad Software公司的GraphPad Prism 6.0软件。
（ https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ）
R软件（R核心团队，2015 R： A语言和统计计算环境）

程序

为了更好地模拟体内肿瘤细胞的生长，我们使用具有细胞外基质蛋白混合物的3D培养系统用于从单细胞发育的肿瘤球体。为了测试在三维培养中shRNA介导的感兴趣基因敲低对肿瘤细胞生长的影响，制备用编码shControl RNA的病毒转导的细胞以及对目的基因特异的shRNA。

注：在文中，“球体”和“肿瘤球体”这两个词用作同义词。

用编码shRNA的病毒转导细胞
1. 在转导时，细胞的汇合应该是约60-70％。吸出培养基，用无菌PBS清洗平板并用胰蛋白酶分离细胞。用含FBS的培养基停止反应，离心（300xg室温，2分钟），用含有SureEntry试剂的PBS洗涤细胞沉淀。对于一次转导，使用不超过50,000个细胞。通过直接混合病毒原液和细胞沉淀，在无菌Eppendorf管中转染癌细胞，先用SureEntry试剂（PBS中SureEntry试剂的终浓度应为8μg/ ml）用无菌PBS（pH7.4）洗涤。对于转导，每50,000个细胞使用10μl高滴度病毒（10 9 TU / ml）。
  备注：
  1. 在将沉淀与病毒溶液混合之前，将上清液吸出，留下少量（〜10μl）含SureEntry的PBS于细胞沉淀上方。将含有残留量的病毒的移液管和小瓶弃于含有10％Clorox漂白剂溶液的塑料瓶中。
  2. 为监测转导效率，可使用对照病毒（例如，Mission pLKO.1-puro-CMV-TurboGFP阳性对照转导颗粒，高滴度）。
  3. 细胞的转导总是在生物安全水平（BSL-2）层流罩中进行。对血液传播的人类病原体采取预防措施，并使用10％漂白剂对该区域进行消毒。
2. 使用镊子小心地将含有转导混合物（细胞和病毒）的开放Eppendorf管转移到50ml Falcon管中。在孵化期间松开Falcon管的盖子以允许气体交换。将含有Eppendorf管的Falcon管转移到培养箱（37℃，5％CO 2）中孵育30分钟。
3. 从培养箱中取出细胞并将它们转移到无菌罩中。加入足够量的培养基（2或3毫升），并将细胞放入6孔板或10厘米培养皿中。
4. 第二天更换培养基（将吸入培养基丢弃到含有10％漂白剂的瓶子中）。允许转导的细胞恢复2-4天（恢复的时间取决于细胞汇合）。
5. 在推荐或预先测试的浓度下添加选择性抗生素以除去未转导的细胞。
6. 保持在培养基中选择抗生素12-14天。
7. 用适当的方法检测转导细胞中基因敲入的效率 - qPCR（mRNA水平）或蛋白质印迹（蛋白质水平）
细胞嵌入ECM蛋白质基质（Matrigel）中的3D球体培养
注意：虽然更困难和更耗时，但在基质中嵌入细胞/球体的3D培养（在我们的实验室中）是检测基因沉默对肿瘤球体生长的影响的首选方法。嵌入固体或半固体蛋白质凝胶基质中的生长球体不具有凝集的趋势（或机会）（图1），这使定量分析（例如，计数球体的数量或测量球体直径）困难。 /

图1.只在CSC培养基中培养的肿瘤球（左图，A）或嵌入基质胶基质（右图，B）。注意只有在CSC培养基中生长时，肿瘤球的聚集趋势。比例尺代表50μm。
1. 使用胰蛋白酶或其他细胞分离溶液从2D平板上分离细胞。停止与含有FBS的培养基的反应，并将细胞从平板转移到15ml Falcon管中。
  在室温下通过离心（2分钟，400μg×g）使细胞沉淀
2. 吸出上清液并重悬细胞沉淀在无菌PBS中。
3. 用70微米细胞过滤器过滤细胞悬液，并手动计数细胞数量或使用自动细胞计数器。
  注意：必须根据经验确定每种类型的癌细胞每孔接种的细胞数量。我们建议从5,000个细胞/孔（24孔板）或10,000个细胞/孔（6孔板）开始并根据需要调整细胞数量（向每孔细胞数量较少）。
4. 通过在室温下离心（2分钟，400μg×g）使细胞旋转下来。
5. 吸出上清液并将细胞沉淀物重新悬浮在无菌培养基（此处缩写为CSC培养基）中，并将具有细胞的Falcon管置于冰上冷却。
6. 移动冰冷的CSC培养基上下数次以冷却塑料吸管。
7. 在冰上移取冰冷生长因子还原基质胶（BD Biosciences，USA）或Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract，PathClear（Trevigen，USA）。用冷冻移液管将Matrigel转移到含有冰冷培养基和细胞的小瓶中。使用至少1：3的比例（1份Matrigel和3份含细胞的冰冷培养基）。
8. 轻轻混合，避免产生气泡。
9. 将混合物放在超低附着表面培养板（美国康宁）上并转移到培养箱中。
10. 第二天，轻轻地添加CSC培养基以覆盖固化的基质：含细胞的培养基。每3-5天添加新鲜的媒体。
  注意：使用移液器吸取旧介质，而不是使用真空泵（可能会吸入带球体的基质胶）。
3D球体培养（基本的，没有ECM蛋白质基质）
1. 通过在300gxg离心2分钟（在室温下）离心沉淀细胞并吸出上清液。
2. 用培养基（此处缩写为CSC培养基）轻轻混合细胞沉淀，并将细胞铺在超低附着板中。
  注意：必须根据经验确定每种类型的癌细胞每孔接种的细胞数量。我们通常会准备好几个孔（连续稀释的细胞），以便找到可以轻松成像的细胞浓度，而不会产生与细胞密度高于最佳密度相关的问题（结块，太密集的球体等）。 br />
3. 我们建议从5,000个细胞/孔（24孔板）或10,000个细胞/孔（6孔板）开始并根据需要调整细胞数量。
4. 培养基补充可以通过添加额外的新鲜培养基（在形成细胞的时间期间在细胞培养后的前2-7天内优选）或完全改变培养基来进行。为了完全改变培养基，从孔中收集浮动细胞并以300×g 离心2分钟。仔细吸取上清液（细胞团有时不可见，因此建议在培养基上留下少量培养基）并添加新鲜的CSC培养基。
  轻轻混匀并将细胞移回平板。
5. 每天监测肿瘤球形成。有时，细胞或球状体在板的中心有聚集的趋势（这是由细胞培养箱的微振动引起的）。在这种情况下，通过轻敲平板轻轻重新悬浮肿瘤球体，或使用血清移液管（无菌罩）机械地重新悬浮肿瘤球。
从人类肿瘤组织建立一个新的初级3D球体培养系统
注：在进行实验之前，请确保从每位患者获得知情同意书，承认使用残留肿瘤组织进行研究。所有涉及人类肿瘤组织研究的程序都必须经过Institutional Review Board（IRB）的批准。所有收集的组织必须被去除识别。
1. 将来自医院的天然肿瘤样品在无菌PBS或培养基中或在冬眠培养基（最佳选择）中（补充有抗生素 - 抗真菌药物（Gibco，Invitrogen）（Hibern's -A，Gibco，Invitrogen）），在冰上。
  注意：肿瘤样本应尽可能新鲜 - 理想情况是直接从手术室接收/转移新鲜分离的肿瘤组织 - 然而，在大多数情况下，实验中使用的组织是剩余（剩余）组织由病理学家。
2. 用补充有抗生素 - 抗真菌药（100x）（Gibco Invitrogen）的无菌PBS洗2次或3次。
  用不含抗生素的PBS进行最后清洗
3. 用手术刀（图2）将肿瘤样品切成小块（1-3mm），并用〜1ml的0.5-1％胶原酶IV（Sigma-Aldrich）溶液将它们转移到Falcon管中。有时，胶原酶消化“太强” - 重要的是监测样品消化（在37℃下每15分钟消化胶原酶中的一小部分组织样品，并用台盼蓝和TC20自动细胞检查细胞的生存力计数器（Bio-Rad）或同等方法）。
  
  图2.肿瘤组织处理方案
4. 将无菌PBS加入具有组织样品的Falcon管中以通过离心（200-500×g，3分钟，室温）洗出胶原酶。
5. 用无菌PBS重悬沉淀并用70μm细胞过滤器过滤细胞。计数细胞。
6. 用i）CSC培养基或ii）与Matrigel（1：3）混合的冰冷的CSC培养基重新悬浮过滤的原代细胞，并且平板成超低附着板。
  每个孔使用多达0.5×10 6个细胞（6孔板）。
7. 每天监测球状体的生长情况。每隔3天添加少量新鲜培养基，而不会干扰嵌入细胞的固相。一旦形成球体，按照下面的描述通过它们。
  备注：
  1. 有时很难在无血清培养基中建立3D培养。我们建议在CSC培养基中培养一至两个培养孔，并补充1％FBS。
  2. 新鲜消化的肿瘤组织也可以用于建立用于2D生长的癌细胞系。在那种情况下，如上所述用胶原酶处理肿瘤组织。一旦消化，用无菌PBS洗涤胶原酶并且不用过滤细胞，在含有DMEM / F12,1％青霉素/链霉素和10％FBS的培养基中重悬细胞碎片/细胞。放入培养皿或6孔板中。
8. 第二天更换媒体以摆脱未连接的（死亡）细胞和碎片。
  注意：对于二维细胞系的生成，我们不会通过细胞过滤器传递细胞 - 最好是在更换介质时将它们种植成团块和“垃圾”，并在第二天清洗未附着的细胞和碎片。 /
传递球体
1. 用移液管小心地从培养皿中吸出培养基，而不是真空吸气器。尽量不要打扰Matrigel中的球状体。
2. 用10毫升移液管收集带有嵌入球体的Matrigel，并将其转移到新鲜的15毫升或50毫升Falcon试管中（图3）。
  
  图3.肿瘤球体传代的程序图
3. 加入10ml分散酶（1U / ml，StemCell Technologies，Canada）并将管置于培养箱（37℃）中30-60分钟。
  在消化过程中轻轻敲击管子几次
4. 一旦球体沉降在管底部，用100μl0.5MEDTA（Gibco，Life Technologies，USA）停止反应，最终EDTA浓度为0.005M，并离心（1分钟，300xg），室温）。
5. 小心弃去上清，加10 ml无菌PBS洗涤。离心1分钟（300×g）并重复2次。
  注：此时，沉淀的肿瘤球可用于基质胶中的进一步扩增，分离RNA（用于qPCR）或用于蛋白质印迹的蛋白质裂解物的制备。
6. 弃去PBS，稍微留在含有肿瘤球的沉淀上方，并加入5ml Accutase（StemCell Technologies，Canada）。请勿紧密关闭Falcon管以允许在培养箱内进行气体交换。
7. 将管置于培养箱（37℃，5％CO 2）中并监测酶反应。
  注意：为了监测酶反应，用10毫升血清移液管上下吸移球体数次。正确消化的球体可以轻松地重新悬浮成单个细胞。
8. 为了制备单细胞悬液，用5毫升血清移液管从消化的球体中重悬沉淀。加入无菌PBS洗涤并离心（300xg，2分钟，室温）。重复2次。
  注意：此时，细胞可用于进一步扩增Matrigel，FACS分析，分离RNA（用于qPCR）或用于蛋白质印迹的蛋白质。
肿瘤球的低温保存
肿瘤球可以以单细胞悬液（用Dispase-Accutase处理制备）或肿瘤球（仅用于Dispase处理）的形式冷冻保存。
1. 将新鲜的CSC培养基与单细胞（0.5×10 6至2×10 6）或肿瘤球体（来自6孔板每个冷冻管的一个孔的肿瘤球体）混合（终体积= 1ml），含有10％DMSO（Sigma-Aldrich，USA），并立即将冷冻管置于Frosty冷冻容器（Thermo Scientific）中。
2. 将Frosty先生转移到-80°C的冷冻箱中。第二天，将带有冷冻肿瘤球/细胞的小瓶转移到液氮储罐中。使用汽相长时间储存肿瘤球/细胞。

数据分析

数据收集和图像分析
在原始文章（Strnadel等人，2017）中，使用运行Nikon Elements软件的尼康TE-2000E D-Eclipse Csi共聚焦显微镜获得成长球体的图像。从每个孔（从5到20个）取得多个场的图像，从中量化肿瘤球的直径和数量。测量每个肿瘤区域的直径（图4）（为了校准测量，如下所述使用来自Nikon显微镜操作软件的比例尺）。未测量细胞团块和单个或死亡细胞的直径（图5），并将这些事件的值设置为0（参见统计分析）。
注意：最理想的是，应该有足够数量的图像覆盖培养板的整个孔。如果不可能，请从每口井取几张有代表性的图像。采用相同数量的shControl图像和shRNA样本。
1. 从3D文化中获取多个图像。确保图像具有嵌入式显微镜操作软件的比例尺。
2. 在ImageJ软件中打开图像。图标菜单栏会弹出。
  注：ImageJ是免费提供的图像处理软件（免费软件）。类似的图像处理程序也可以使用。
3. 点击位于ImageJ菜单栏上的“Oval”选择图标。
4. 通过将椭圆选择门适配到每个特定的球体，测量每个球体的直径（以像素为单位）。
  。球体的宽度代表其直径（d）。
5. 测量比例尺的长度（单击ImageJ菜单中的直线图标）。将测量的直径值（以像素为单位）与已知长度的比例尺进行比较。计算每个球体的直径。
  
  图4.肿瘤直径的测量在ImageJ程序中拍摄并打开图像。圆形的宽度，准确地拟合到特定的肿瘤区域代表其直径（d）。使用比例尺校准测量（比例尺代表100μm）。
  
  图5.由编码对照shRNA（A）或感兴趣基因的shRNA（在这种情况下为PEAK1;富伪蛋白非典型激酶1）的病毒转导的胰腺癌细胞建立的肿瘤球的代表性图像（B） >。当两组之间的肿瘤大小比较时，PEAK1基因沉默的显着效果是可见的。从分析中排除了聚集的细胞和单细胞事件。比例尺代表100μm。
统计分析
如原始论文的“统计分析”部分（Strnadel等人，2017）所述，在GraphPad Prism 6.0软件中绘制和分析数据。对于在生物统计方法方面更有经验且熟悉R em软件的用户，我们推荐采用以下数据处理策略：[由于]由于团块的存在，球体直径的概率密度为 - 双峰（图6为例子），Wilcoxon双样本测试似乎比原始文章中使用的测试更适合。另外值得一提的是shControl和shRNA中团块的概率相等可以通过对样本比例相等的双样本检验来检验。
为了说明，我们提供了以下数据集的肿瘤球直径的数据分析结果。
shControl：213μm，124μm，316μm，173μm，284μm，373μm，311μm，404μm，440μm，351μm，204μm，231μm，147μm，151μm ，160微米，227微米，151微米，151微米，89微米，333微米，338微米，80微米，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0微米）。
的的shRNA： 84微米，102微米，107微米，102微米，124微米，84微米，93微米，102微米，129微米，107微米，102微米，102微米，107微米，0， 0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0， 0，0μm）。

图6.球体直径的概率密度，由核密度估计器估算

图6显示了shControl和shRNA的球体直径概率密度的核密度估计。核密度估计是一个平滑的直方图。由团块的存在（即，二维细胞）引起的分布的双模式清晰可见。 Boxplot与数据的swarmplot如图7所示。
对于shControl和shRNA中的直径的中值的平均值的Wilcoxon测试导致0.00006的em值，并且shControl和shRNA的中值之间的差值为124.4μm。

图7.带有数据交换空间的Boxplot

shControl中的群体比例是否与shRNA中的群体比例相同，当通过两个样本比例测试得出时，导致0.1036的95％置信区间和95％置信区间的95％置信区间shControl和shRNA之间的比例差异（-0.5716，-0.0884）。
在shControl中团块的比例是0.3529，而在shRNA群体中是0.6829。
数据分析在R软件中进行，使用函数 wilcox.test ， prop.test ， density ， boxplot 和 beeswarm 。

笔记

病理学家提供的新鲜肿瘤组织通常是非消毒或污染的。基于我们的经验，我们强烈建议在加工前对肿瘤组织进行消毒。您可以用70％乙醇对组织进行消毒（将组织浸入70％乙醇中3-5秒或用乙醇喷雾肿瘤组织）。用乙醇灭菌后立即用过量的无菌PBS清洗组织，然后继续胶原酶处理。

食谱

用于编码病毒的shRNA转导细胞的培养基
注意：将所有组件放在无菌罩中，并在4°C下保存

500ml DMEM / F12，Glutamax（Gibco，Thermo Fisher Scientific，USA） 1％青霉素/链霉素（Gibco，Thermo Fisher Scientific，USA）
10％胎牛血清（Gibco，赛默飞世尔科技，美国）
CSC中等
注意：
1. 将所有组分混合在无菌罩中并在4°C下储存长达2周。每次使用培养基时添加新鲜的bFGF和EGF的等分试样。
2. *将等分试样储存在-20°C。
3. **保护等分样品不受光照影响，并保存在-20°C。
4. 肝素是一种抗凝剂（可防止细胞结块）并增加FGF的稳定性和功能。存放在2-8°C。
485 ml DMEM / F12 GlutaMAX（Gibco，Life Technologies，USA）
5毫升青霉素/链霉素100x（Gibco，Life Technologies，USA）
10ml B27补充剂50x（无血清）（Gibco，Life Technologies，USA）
* bFGF-人成纤维细胞生长因子147碱性（无动物）（Gemini Bio-Products，USA），终浓度20ng / ml
* EGF-表皮生长因子（人）（Gemini Bio-Products），最终浓度为20ng / ml。
** ROCK抑制剂（Y-27632）（StemCell Technologies，Canada），最终浓度为10μM
肝素溶液（Stemcell Technologies，Canada），终浓度2μg/ ml

致谢

这些实验方案已经在以前发表过，并在此以原始形式和修改后的形式从Strnadel et al。，2017发表。作者要感谢来自加利福尼亚大学圣地亚哥分校病理学系的Richard Klemke教授）为他的支持。特别感谢来自捷克共和国Libachov IAPG的Vratislav Horak博士，来自马丁的Jessenius医学院外科和移植中心诊所的Dr.Michal Kalman，Dr.Juraj Marcinek和Luukas Plank教授以及Ludovit Laca教授以及来自布拉迪斯拉发Comenius大学Martin Martin医学院外科和移植中心诊所的Jan Janik博士。这项工作得到了原始文章（Strnadel 等）中列出的赠款的支持。 2017），研究与发展支持机构（APVV-15-0217）的拨款以及由欧盟资助的共同出资的“生物医学中心Martin”项目（ITMS代码26220220187）。本出版物也是项目实施的结果：“翻译医学中心”，ITMS：26220220021，由ERDF资助的运营计划研究与创新提供支持。所有作者声明不存在利益冲突。

参考

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Johnson，S.，Chen，H.和Lo，P.（2013）。体外肿瘤球体形成分析。 Bio-protocol 3（3）：e325。
Pampaloni，F.，Reynaud，E.G。和Stelzer，E.H。（2007）。第三个方面弥补了细胞培养和活组织之间的差距。 Nat Rev Mol Cell Biol 8（10）：839-845。
R核心团队（2015）。 R：统计计算的语言和环境。< / a> R统计计算基金会，奥地利维也纳。（ https://www.R-project.org/ ）
Strnadel，J.，Choi，S.，Fujimura，K.，Wang，H.，Zhang，W.，Wyse，M.，Wright，T.，Gross，E.，Peinado，C.，Park，HW，Bui ，J.，Kelber，J.，Bouvet，M.，Guan，KL和Klemke，RL（2017）。 eIF5A-PEAK1信号调控YAP1 / TAZ蛋白表达和胰腺癌细胞生长 < Cancer Res 77（8）：1997-2007。
Weiswald，L.B.，Bellet，D。和Dangles-Marie，V。（2015）。肿瘤生物学中的球形癌模型 <瘤形态 17（ 1）：1-15。