材料和试剂

96孔细胞培养板（SPL Life Sciences，目录号：30096）
试管
棉签（HUBY-340-CA-006）
过滤器（颇尔，目录号：4612）
培养皿（Corning，Gosselin TM，目录号：SB93-101）
电子。大肠杆菌DH5α（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：12297016）
电子。大肠杆菌BL21（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：C600003）
pET15b
5x Green GoTaq Flexi反应缓冲液（Promega，目录号：M8911）
2.5mM dNTP混合物（Takara Bio，目录号：4030）
氯化镁（UniChem，产品目录号：M04550-4G）
引物（由BGI合成）
rTaq（Takara Bio，目录号：R001WZ）
PBS（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，产品目录号：10010023）
1倍TAE（见食谱）
Milli-Q水
QIAquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28704）
DNase I（Sigma-Aldrich，目录号：DN25-1G）
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：SM 1331）
凝胶上样染料（新英格兰生物实验室，目录号：B7024S）
SacI-HF（New England Biolabs，目录号：R3156S）
BamHI-HF（New England Biolabs，目录号：R3136S）
CutSmart®缓冲液（New England Biolabs，目录号：B7204S）
T4 DNA连接酶（New England Biolabs，目录号：M0202S）
10x T4 DNA连接酶缓冲液（New England Biolabs，目录号：B0202S）
Tris（IBI Scientific，目录号：IB70145）
EDTA（Merck，目录号：1.08421.1000）
冰醋酸（DUKSAN，目录号：3839）
琼脂糖，分子生物学认证（IBI科学，目录号：IB70045）
10,000x Gold View I（West Gene，产品目录号：WGO-1）
LB肉汤（Hopebio，货号：HB0128）
LB营养琼脂（Hopebio，目录号：HB0129）
氨苄青霉素钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：A9518-100G）
QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN，目录号：27106）
异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷，IPTG（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-202185B）
Mueller-Hinton肉汤，MH肉汤（BD，BBL TM，目录号：212322）
Mueller-Hinton琼脂，MH琼脂（Hopebio，目录号：HB6232）
头孢噻肟钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：C7912-1G）
氯化钠（VWR，目录号：VWRC27810.295）
50 mM氯化镁（见食谱）
50倍TAE缓冲液（见食谱）
1％琼脂糖凝胶（见食谱）
10倍DNA酶I反应混合物（见食谱）
LB肉汤（请参阅食谱）
25毫克/毫升氨苄青霉素（见食谱）
0.5 M IPTG（见食谱）
MH肉汤（见食谱）
MH-IPTG（见食谱）
MH琼脂（见食谱）
盐水（见食谱）

设备

Bio-Rad S1000 TM热循环仪（Bio-Rad Laboratories，型号：S1000 TM）
离心机（Hettich Instruments，型号：Mikro 185）
用于电泳的电源板（Labnet International，型号：ENDURO TM 300V，目录号：E0303）
凝胶罐
紫外透照器
分光光度计（Hach，型号：DR 2800 TM）
常规水浴（42°C用于转化）
常规高压灭菌器
微波炉
pH计

软件

PyMOL软件
BioEdit序列对齐编辑器

程序

协议的大纲如图1所示。

图1. DNA改组计划

DNA洗牌
1. 通过PCR扩增目标基因的全长
  注意：正向和反向引物应包含用于后续克隆的限制性位点。
  1. 用5×PCR缓冲液，3mM MgCl 2，200μM脱氧核苷三磷酸，0.5μM引物和1U Taq DNA聚合酶制备20μlPCR反应物。
  2. 加1μlDNA模板。
    注意：通过在300μlPBS中煮沸500μl过夜培养物5分钟准备DNA模板。通过以16,000×g离心3分钟收集上清液。
  3. 运行PCR程序（目标小于1 kb）：
2. 在150V电压下进行PCR产物的1x TAE电泳15-30分钟
3. 将凝胶放在紫外透射仪（设置在365nm波长）。
4. 剪下DNA带，用凝胶提取试剂盒回收。
5. 用0.02单位的DNA酶I和10x DNA酶I反应混合物在室温下100μl反应中消化2μgDNA模板10-20分钟。
6. 加入凝胶加载染料。
7. 运行凝胶电泳并通过凝胶提取试剂盒回收50至200bp的DNA片段。
8. 不用引物，通过PCR重新组装片段。
  1. 用5x PCR缓冲液，3mM MgCl 2，200μM脱氧核苷三磷酸和1U Taq DNA聚合酶制备100μlPCR反应。
  2. 使用10 - 30 ng /μl的纯化片段作为模板
  3. 运行程序：
9. 在电泳时通过凝胶提取试剂盒纯化正确大小的PCR产物（取决于目标基因的大小）。
10. 在上述条件下再次进行PCR，不同之处在于此次使用0.5μM的每种引物。
  注：当观察到与目标基因大小相似的DNA条带时，该方案起作用。如果回收的DNA的浓度低，则可以在随后的限制性消化反应中添加更多的量。
将目标基因克隆到表达载体中
1. 在20μl反应中，分别用0.6μlSacI-HF，0.6μlBamHI-HF和10xCutSmart®缓冲液消化600 ng PCR产物和pET15b。
  注：如果选择的限制性位点不存在于野生型靶基因中，则在正向和反向引物中包含限制性位点。然而，在重组的突变体上不能保证限制性位点的产生。
2. 进行凝胶电泳并通过凝胶提取试剂盒回收DNA
3. 使用5-10 ng DNA，20-30 ng载体，1μlT4 DNA连接酶和10 x T4连接酶缓冲液在20μl反应液中16℃过夜。
4. 将矢量转换为 E。大肠杆菌DH5α。
  按照制造商提供的协议进行修改并进行改造。见下文：
  1. 在冰上孵育10μl载体并加入100μl感受态细胞30分钟。
  2. 热冲击2分钟。
  3. 在冰上孵育5分钟。
  4. 加500μlLB肉汤。
  5. 在37°C孵育1小时
  6. 在100μg/ ml氨苄青霉素平板上选择。
5. 使用A1中的相同引物和条件进行菌落PCR以检查插入物的存在。
6. 对含有插入片段的转化子进行测序。
7. 通过QIAprep Spin Miniprep Kit提取质粒。
8. 转换 E。大肠杆菌BL21感受态细胞与含有突变基因的质粒。
抗菌药物敏感性试验
1. 加入150μlMH-IPTG到96孔板的每个孔中
2. 加入150μlMH-IPTG肉汤至96孔板的最后一栏
3. 在最后一栏添加抗生素。测试范围取决于不同抗生素的耐药折点;
  是512μg/ ml是头孢噻肟的最大浓度
4. 沿着行执行两倍连续稀释。
5. 将3ml盐水转移到n个（测试菌株的数量）试管中。
6. 将试验菌株从MH琼脂过夜培养转移至步骤C5中制备的试管中，通过棉拭子获得OD 600≤0.08-0.1的悬浮液。
7. 将5μl悬浮液转移到96孔板的每个孔中。
8. 在37°C孵育过夜
9. 记录最小抑制浓度（MIC）。
  注意：MIC是没有观察到细菌生长的最小测试浓度。

数据分析

按两个方向（向前和向后）对目标插页进行排序。将突变体序列与野生型序列对齐以鉴定突变。从蛋白质数据库获取蛋白质结构（ http://www.rcsb.org/pdb。用PyMOL软件分析蛋白质结构。

BioEdit分析测序数据（图2）

图2.测序数据分析
1. 编辑→将序列复制到剪贴板（Fasta格式）
2. 将反向序列与正向序列一起导入：文件→从剪贴板导入
3. 一起加入正向和反向序列：突出显示两个序列→单击'附件应用程序'→CAP重叠群组装程序
4. 将序列与野生型对齐（图3）
图3.突变体与野生型序列的比对通过CTX-M-14和CTX-M-15的重组产生H11。
核苷酸编号299之前的序列来自CTX-M-15，而299之后的序列来自CTX-M-14。
用PyMOL分析蛋白质结构
对其中特定氨基酸取代引起MIC显着降低的蛋白质进行结构分析。所关注的氨基酸的位置通过PyMOL可视化。观察当地环境并鉴定附近残基之间可能的相互作用有助于找出表型变化的分子基础。有关PyMOL的CTX-M-14的详细结构信息，请参阅Po et al。，2017。

食谱

50 mM氯化镁
将0.238g MgCl 2溶解于50ml ddH 2 O中
在121°C高压灭菌15分钟
50倍TAE缓冲区
将242克Tris溶于600毫升ddH2O中加57.1ml冰醋酸和100ml 0.5M EDTA
调整pH值至8
将ddH 2 O添加到1 L
最终（1x）工作浓度：
0.04 M Tris
0.001 M EDTA
1x TAE缓冲区
将100ml 50x TAE缓冲液混合至4900ml ddH 2 O
1％琼脂糖凝胶
将1克琼脂糖与100毫升1倍TAE缓冲液混合
热量通过微波溶解
添加1μl10,000x Gold View I
10倍DNase I反应混合物
解散：
6克Tris
0.095克MgCl 2 2/2 调整pH值到7.4
将ddH <2> O加入100毫升
LB肉汤
将12.5g的LB粉溶于500ml ddH 2 O中
在121°C高压灭菌15分钟
25毫克/毫升氨苄西林
将1.25g氨苄青霉素钠盐溶解于50ml ddH 2 O中过滤消毒
100μg/ ml氨苄西林平板
将20克LB粉溶于500毫升ddH 2 O中
在121°C高压灭菌15分钟添加2毫升25毫克/毫升氨苄青霉素
0.5 M IPTG
将5.96g IPTG溶解于50ml ddH 2 O中过滤消毒
MH肉汤
将11g MH肉汤粉溶于500ml ddH 2 O中
在121°C高压灭菌15分钟
MH-IPTG

加入100μl0.5 M IPTG至50 ml MH肉汤中
MH琼脂
将21克MH琼脂粉溶于500毫升ddH 2 O中
在121°C高压灭菌15分钟
盐水
将4.5g氯化钠溶解于500ml ddH 2 O中
在121°C高压灭菌15分钟

致谢

这项工作以前发表在Po等人，2017年。这项工作得到了研究基金委员会的合作研究基金（C7038-15G和C5026-16G）以及卫生和医疗香港特区政府食物及卫生局研究基金（HMRF：14130422至SC）。
这
工作已经在2017年的Po等人中发表过。这项工作得到了Collaborative的支持。
研究资助委员会研究基金（C7038-15G和C5026-16G）和
食品和卫生局的健康和医学研究基金，
香港特区政府（HMRF：14130422至SC）。
潜在的利益冲突：所有作者声明不存在需要披露的冲突。所有作者声明不存在需要披露的冲突。

参考

Crameri，A.，Raillard，S.A.，Bermudez，E。和Stemmer，W.P。（1998）。来自不同物种的基因家族的DNA改组加速了定向进化。 Nature 391（6664）：288-291。
He，D.，Chiou，J.，Zeng，Z.，Liu，L.，Chen，X.，Zeng，L.，Chan，E.W.，Liu，J.H。和Chen，S。（2015）。活性位点远端的残基有助于提高来源于CTX的变异株和杂种β-内酰胺酶的催化活性-M-14和CTX-M-15。抗菌剂Chemother 59（10）：5976-5983。
Liu，L.，He，D.，Lv，L.，Liu，W.，Chen，X.，Zeng，Z.，Partridge，S.R。和Liu，J.H。（2015）。 blaCTX-M-1/9/1杂种基因可能由blaCTX-M-15产生在IncI2质粒上。抗微生物剂Chemother 59（8）：4464-4470。
Nagano，Y.，Nagano，N.，Wachino，J.，Ishikawa，K.and Arakawa，Y。（2009）。新型嵌合型β-内酰胺酶CTX-M-64，CTX-M-15样杂合体和CTX-M-14β-内酰胺酶，发现于对各种氧亚氨基 - 头孢菌素（包括头孢他啶）耐药的志贺氏痢疾志贺菌菌株中抗微生物剂化学疗法 53（1 ）：69-74。
Po，K.H.L.，Chan，E.W.C。和Chen，S。（2017）。通过 CTX-M-14和CTX-M-15β-内酰胺酶的功能表征在体外 DNA Shuffling。抗菌剂Chemother 61（12）。
Tian，G.B.，Huang，Y.M.，Fang，Z.L.，Qing，Y.，Zhang，X.F.and Huang，X.（2014）。 CTX-M-137，CTX-M-14-like和CTX-M-137的混合物，在大肠杆菌临床分离株中鉴定出15-样β-内酰胺酶。 J Antimicrob Chemother 69（8）：2081-2085。