材料和试剂

移液器吸头（Fisher Scientific，产品目录号：02-707-417,02-707-408,02-707-438）
1.5 ml Eppendorf微量离心管（Diamed Advan Tech，目录号：AD150-N）
Slide-A-Lyzer®MINI透析装置7K MWCO，0.1ml（Thermo Fisher Scientific，目录号：69560）
Slide-A-Lyzer MINI透析装置3.5K MWCO，0.5ml / 2ml（Thermo Fisher Scientific，目录号：88400/88403）
皮尔斯强阴离子交换旋转柱，迷你（Thermo Fisher Scientific，目录号：90010）
C57Bl / 6雌性小鼠
无菌去离子水
NaOH（BioShop，目录号：SHY700.500）
Tris碱（121.1克/摩尔）（BioShop，目录号：TRS001.1）
NaCl（58.44克/摩尔）（BioShop，目录号：SOD001.10）
SDS（BioShop，目录号：SDS001）
CaCl 2·2H 2 O（147.0克/摩尔）（Sigma-Aldrich，目录号：C3306）
PBS（WISENT，目录号：311-425-CL）
蛋白酶K（Roche Diagnostics，目录号：03115879001），重组PCR，等级
注：使用Chromozym测定法测定时约为2.5U / mg，用血红蛋白测定法则约为30U / mg。
氯仿（试剂级，Acros Organics，目录号：423555000）
乙醇（EtOH），100％
甲磺酸去铁胺盐（=去铁胺甲磺酸盐）（657克/摩尔）（Sigma Aldrich，目录号：1166003）
Benzonase（Sigma-Aldrich，目录号：E1014）重组250U /μl
0.2 M NaOH（见食谱）
1 M Tris pH 8.3（见食谱）
5 M NaCl（见食谱）
10％SDS（见食谱）
1 M CaCl 2 （见食谱）
蛋白酶K溶液，20毫克/毫升（见食谱）
甲磺酸去铁胺溶液，50毫克/毫升（见食谱）
组织裂解缓冲液（见食谱）
0.1 M NaCl（见食谱）
Benzonase消化缓冲液（见食谱）
用于离子交换（IEX）分离的NaCl溶液（参见食谱）

设备

移液器（Drummond Scientific，Pipet-Aid ，型号：XP ^{2 ）}
移液器（Gilson，型号：PIPETMAN®Classic Classic）
培养箱可容纳37°C（VWR，型号：1510 E）
Eppendorf Thermomixer（Eppendorf，型号：ThermoMixer®R）
能够使用18,000×g（Thermo Fisher Scientific，型号：Sorvall TM Legend TM Micro 21R）的冷冻台式微量离心机。
包含在Sorvall TM TM Legend TM TM Micro 21R中的转子
易燃材料储存冷冻柜，-20°C
费舍尔科学搅拌热板
生物危害/层流罩
数字分析天平秤（美国固体商店，型号：USS-DBS5）;重复性：±0.2毫克
平衡量表（Denver Instrument，型号：XS-310 D，重复性±0.02 g）
pH计（Fisher Scientific，型号：accumet TM TM AR15）
荧光辅助碳水化合物电泳（FACE）

程序

注意：透析和沉淀步骤不会导致小至4kDa的HA片段损失

HA从小鼠乳腺中提取
如Tolg等人（回顾）步骤2-3中所述从8周龄C57Bl / 6雌性小鼠中分离乳腺。典型的HA产量是5-15μg/ 100mg组织。
1. 将800μl组织裂解缓冲液添加到50-200mg乳腺组织中。
2. 在55°C孵育样品16-24小时。在孵育过程中混合样品，Eppendorf Thermomixer在500 rpm混合速度下效果良好。
3. 第二天，在室温下离心消化样品18,000×g（13,000rpm）5分钟。这一步消除未消化的碎片。处理未消化的碎片作为生物危害。
4. 将上清液倒入新的Eppendorf微量离心管中。
5. 通过加入11.7mg NaCl粉末/100μl样品将样品的NaCl浓度增加至2M。将样品颠倒10次后溶解NaCl粉末，然后让样品静置1分钟，使未溶解的NaCl晶体沉入管子的底部，以便它们可见。如有必要，重复混合直至NaCl溶解。 NaCl需要几分钟才能溶解。
6. 通过氯仿提取去除蛋白酶K：确定样品体积并将相同体积的氯仿加入样品中，并通过倒置数次使样品混合。
7. 以18,000×g（13,000rpm）离心样品10分钟以分离水相和氯仿相。
8. 将上层水相（图1）转移到新的Eppendorf管中并重复氯仿萃取（步骤A6）。
  
  图1.水相和氯仿相的分离离心后，水相（顶部）和氯仿（底部）相清晰可见。
9. 以18,000×g（13,000rpm）离心样品10分钟，并将上层水相转移到新的Eppendorf管中。
10. 通过0.1 M NaCl渗析降低NaCl浓度：移除每个样品的80％水相并转移到两个MINI透析装置（7,000 MWCO，0.1 ml容量）中。将透析装置加入装有4 L 0.1 M NaCl的烧杯中，并在4°C透析2 h。在透析过程中，使用磁力搅拌板缓慢搅拌0.1M NaCl。
11. 通过乙醇沉淀沉淀HA：将来自透析单元的样品转移到1.5ml微量离心管中，加入4体积100％EtOH，混合，然后在-20℃下储存16-24小时。样品可以在-20°C下保存长达一周。
12. 在18,000×g（13,000rpm），4℃下离心样品30分钟。
13. 去除上清液并作为化学废物丢弃。向沉淀中加入500μl冷70％乙醇。在18,000×g（13,000rpm），4℃下混合并重复离心10分钟。
14. 去除上清液并作为化学废物丢弃。保持样品管在细胞培养或层流罩下保持1小时以使HA颗粒干燥。
15. 通过用核酸酶Benzonase消化去除共沉淀的DNA：将HA沉淀溶解在100μl含有500U Benzonase的50mM Tris pH8.3,20mM NaCl中并在37℃消化4小时。
16. 如步骤A5所述，通过将11.7毫克NaCl粉末直接溶解在样品中，将样品的NaCl浓度提高到2M。
17. 确定样品体积并向样品中加入相同体积的三氯甲烷，并倒转数次使样品混合。
18. 以18,000×g（13,000rpm）离心样品10分钟以分离水相和氯仿相。
19. 取出每个样品的80％水相并转移到两个MINI透析单位7,000 MWCO，0.1 ml容量。将透析装置加入装有4 L 0.1 M NaCl的烧杯中，并在4°C透析2 h。在透析过程中，使用磁力搅拌板缓慢搅拌0.1M NaCl。
20. 从透析装置转移样品，加入4体积的100％乙醇，混合，然后在-20℃保存16-24小时。样品可以在-20°C储存长达一周。
21. 在18,000×g（13,000rpm），4℃下离心样品30分钟。
22. 去除上清液并加入500μl冷的70％乙醇。在18,000×g（13,000rpm），4℃下混合并重复离心10分钟。
23. 去除上清液并作为化学废物丢弃。
  保持样品瓶在细胞培养或层流罩下保持1小时，让HA颗粒干燥。
24. 将HA溶于50μl去离子H 2 O中。
25. 。每100毫克组织的产量通常约为5-15微克HA
进一步通过离子交换（IEX）纯化和分离大小。
备注：
1. 该技术是一种逐步洗脱技术，包括IEX离心柱的预洗和平衡，HA样品加载和通过施加浓度渐增的NaCl溶液进行样品洗脱。该技术能够去除一些非HA污染物，并且将多分散HA样品分馏成ca之间的低多分散性（即，窄粒径范围）分数。 7和100kDa，但不能低分子量分离更高分子量的HA组分。在IEX分馏中没有观察到任何大小的HA的优先样品损失。由于柱材料（基于再生纤维素的膜）的多孔结构（3μ），非常高分子量的HA也可以从柱中洗脱出来而没有样品损失。
2. 所有相关的解决方案和设备在使用前必须处于室温下。温度影响从IEX柱洗脱的HA的大小。如果使用冷洗脱溶液，HA将以低于预期的盐浓度过早洗脱。洗脱重复性也强烈依赖于离心时间和施加到IEX色谱柱的力。施加于IEX旋转柱的离心力和时间需要保持恒定，并且力推荐不高于400×g。更高的力可能会导致色谱柱过早释放HA。
3. 将通过的液体收集在1.5ml微量离心管中，盖子打开并指向转子的中心。始终将IEX柱中的打印字母Q对准固定角转子的中心，使溶液均匀地通过柱树脂。对于每一步，在400×g下离心2-5分钟。建议旋转2分钟并检查溶液是否已通过。每次旋转1分钟并重复检查，直到所有溶液都已通过。重要的是不要过度旋转柱子。在洗脱步骤之间不要等待很长时间，因为色谱柱可能会变干并阻止溶液和样品的适当洗脱。
4. 如果样品体积比400μl大得多，可以使用几个色谱柱。这比重复加载单个列更好。
5. 样品的pH值应该高于〜5。 HA的pKa约为3.2，NaCl溶液的pH约为5.6。
6. 用NaCl浓度为0.9-2.0M洗脱硫酸化糖胺聚糖进行洗脱。
1. 样品准备
  HA样品装载在0.1M NaCl中。 HA储备浓度应该低于约0.5μg/μl。您将使用400μl的每个样品。每列最大负荷约为200μg。如果从去离子水中的HA样品开始，加入2M NaCl以使最终盐浓度达到0.1M。
2. 预清洗和平衡IEX柱
  我们发现样品洗脱过程中可能会从柱子上脱落出一种未知的（可能是阳离子的）物质，然后在分馏和透析后导致HA沉淀。因此，IEX柱用400μl0.1M NaCl预清洗一次，然后用400μl0.800M NaCl预清洗3次，然后在使用前用400μl0.100M NaCl洗涤5次再平衡。
3. 在列
  上加载样本将400μlHA样品溶液（在0.1M NaCl中）加载到柱上并在400×g下离心2分钟。
4. 通过未结合或弱结合的材料清洗
  1. 用400μl0.1 M NaCl洗柱以完全洗脱未结合的中性或带正电荷的污染物。
  2. 然后用400μl0.2 M NaCl洗涤柱子三次以除去任何弱结合的杂质。只有小于〜4kDa的HA（10个长的双糖）才会在此浓度下洗脱。可以使用0.2M NaCl收集的级分通过荧光辅助碳水化合物电泳（FACE）分析HA寡聚体。
5. HA分数洗脱
  通过增加每次洗脱中的NaCl浓度，从低至高分子量洗脱HA。对于每次洗脱，需要2次洗涤以完全洗出该HA部分。将来自相同NaCl浓度的洗脱液组合用于透析。 HA将通过0.3至0.8M的NaCl溶液洗脱。在一定范围的NaCl浓度洗脱的HA的分子量列于下表（表1和表2）。
  
  表1.摘要IEX步骤，4步法
  
  表2.在不同NaCl浓度洗脱的HA尺寸特征
6. 从HA级分中去除NaCl：浓缩或干燥前彻底透析去离子水。含有盐的HA溶液的离心浓度会导致HA降解。或者，用4体积EtOH沉淀HA。

数据分析

可以使用ELISA试剂盒（例如试剂盒K-1200，ECHELON）或通过琼脂糖凝胶电泳和图像分析对纯化的HA级分进行定量。

食谱

0.2 M NaOH
将0.8克NaOH溶于100毫升去离子水中
1 M Tris pH 8.3
1. 将12.1克Tris粉末溶于80毫升去离子水中
2. 用12 N HCl调节pH至8.3
3. 加入去离子水至最终体积为100毫升
4. 高压灭菌器
5 M NaCl
1. 溶解去离子水中的29.22克NaCl至最终体积为100毫升
2. 高压灭菌器
10％SDS
将10克SDS粉末溶于100毫升去离子水中
1 M CaCl 2 2
1. 在去离子水中溶解14.7克CaCl 2·2H 2 O至最终体积为100毫升。
2. 高压灭菌器
蛋白酶K溶液，20毫克/毫升
注意：通过Chromozym测定法测定时为25U / ml，或用血红蛋白测定法测定时为300U / ml。
1. 溶解1毫升PBS缓冲液中的20毫克蛋白酶K.
2. 分成0.1毫升等分试样并储存在-20°C
甲磺酸去铁胺溶液，50mg / ml（= 0.076M）
1. 50毫克甲磺酸去铁胺溶解在1毫升去离子水中
2. 分成50μl等分试样并储存在-20℃
组织裂解缓冲液
1. 预混合缓冲液储存：
  15 ml 1 M Tris pH 8.3
  3 ml 5 M NaCl
  1毫升1M氯化钙2
  1毫升10％SDS
  80毫升无菌去离子水
  注：该缓冲液储备组合物是0.15M Tris pH 8.3,0.15M NaCl，0.01M CaCl 2，0.1％SDS。
2. 在使用前，将100μl蛋白酶K溶液和657μl甲磺酸去铁胺溶液加入10ml以上的缓冲液中。
3. 组织裂解缓冲液中的最终组合物是：
  0.2mg / ml蛋白酶K（Chromzym测定2.5U / ml或血红蛋白测定30U / ml）
  3.285mg / ml（0.005M）甲磺酸去铁胺
0.1 M NaCl

在去离子水中溶解5.8克NaCl至最终体积1升
Benzonase消化缓冲液

50 mM Tris pH 8.3 20 mM NaCl
500U / ml Benzonase
1. 加入5 ml 1M Tris pH 8.3和0.4 ml 5 M NaCl至94.6 ml去离子无菌水
2. 在使用前，将20μlBenzonase加入到1ml消化缓冲液中
用于离子交换（IEX）分离的NaCl溶液
注意：在IEX实验前一天准备NaCl溶液。将所有溶液置于室温下过夜。
1. 用于IEX的2.00M NaCl储备溶液：将11.688g NaCl溶于去离子水中
2. 水终于达到100毫升
3. 稀释的NaCl溶液用于洗涤和洗脱IEX柱
4. 如下所述制作2M NaCl储备溶液的稀释液：

致谢

这项工作得到了CBCF对ET和Endre A.Balazs基金会对MC的资助。该协议改编自Tolg et al。（2012和2017）和Yuan et al。（2015）。作者没有利益冲突。

参考

Calabro，A.，Benavides，M.，Tammi，M.，Hascall，V.C和Midura，R.J。（2000）。荧光辅助碳水化合物电泳（FACE）对透明质酸和软骨素/硫酸皮肤素酶消化物的微量分析。 Glycobiology 10（3）：273-281。
Tolg，C.，Cowman，M.和Turley E.乳房整个安装座。 Bio-protocol （印刷中）。
Tolg，C.，Hamilton，SR，Zalinska，E.，McCulloch，L.，Amin，R.，Akentieva，N.，Winnik，F.，Savani，R.，Bagli，DJ，Luyt，LG，Cowman，MK ，McCarthy，JB和Turley，EA（2012）。 RHAMM模拟肽可阻断乙酰透明质酸信号传导并减少切除皮肤伤口的炎症和纤维化。 Am J Pathol 181（4）：1250-1270。
Tolg，C.，Yuan，H.，Flynn，SM，Basu，K.，Ma，J.，Tse，KCK，Kowalska，B.，Vulkanesku，D.，Cowman，MK，McCarthy，JB和Turley，EA 2017年）。透明质酸以尺寸依赖的方式调节生长因子诱导的乳腺分支。 Matrix Biol 63：117-132。
Yuan，H.，Amin，R.，Ye，X.，de la Motte，C.A。和Cowman，M.K。（2015）。人乳中透明质酸分子量分布的测定 Anal Biochem < / 474：78-88。