材料和试剂

外科
1. 无菌手术刀刀片＃10（Fine Scientific Tools，目录号：10100-00）
2. 钝的16号针头（STEMCELL Technologies，目录号：28110）
3. 1毫升注射器×5（BD，目录号：309659）
4. 静脉注射导管24G×5/8“（Smiths Medical，Jelco ，目录号：4073）
5. 丝线5-0，P-3反向切割（Ethicon，PERMAHAND ®，目录号：640G）
6. Sprague-Dawley大鼠，雄性，〜500克，15-20周龄（Charles River）
7. 异氟醚USP 99％（Fresenius Kabi，目录号：CP0406V2）
8. 高纯度压缩氧气99.995％（普莱克斯）
9. 压缩的一氧化二氮气体纯度达99％（普莱克斯）
10. Betadine TM手术磨砂（Fisher Scientific，目录号：19-027132）
  制造商：Purdue Pharma，目录号：6761815117 。
11. 无菌盐水，0.9％NaCl（Baxter，目录号：2B1324X）
12. 玫瑰孟加拉（Sigma-Aldrich，目录号：330000）
13. 0.25％布比卡因（Sigma-Aldrich，目录号：B5274）
14. 丁丙诺啡（先灵葆雅，0.2毫克注射剂）
15. 玫瑰孟加拉解决方案（见食谱）
灌注
1. Euthasol （VIRBAC，目录号：710101）
2. 咖啡因等渗盐溶液（Fisher Scientific，目录号：351142-10）
  制造商：SCP SCIENTIFIC，目录号：CS20310D
3. 肝素（Sigma-Aldrich，目录号：H3393）
4. 福尔马林1:10稀释，缓冲（Fisher Scientific，目录号：SF100-20）
5. 等渗盐水肝素（5,000 IU / L）溶液（见食谱）
6. 4％福尔马林溶液（见食谱）
组织冷冻切片
1. Superfrost 加上金色幻灯片（Fisher Scientific，目录号：22-035813）
2. 2-甲基丁烷（Sigma-Aldrich，目录号：277258）
3. D-蔗糖（Fisher Scientific，目录号：10638403）
4. 组织Tek OCT化合物（Sakura，目录号：4583）
5. 30％蔗糖溶液（见食谱）
中风分析
1. 大鼠地图集（Paxinos，George和Charles Watson，立体定位坐标中的大鼠脑：硬封面版，通过Elsevier访问在线，2006年，由Matt Gaidica提供的工具）

设备

直肠温度计加热垫（Stoelting，目录号：50300）
无菌Crile hemostat（Fine Science Tools，目录号：13004-14）
无菌钝头剪刀（Fine Science Tools，目录号：14001-18）
无菌咬骨钳（精细科学工具，目录号：16000-14）
硬质合金钻头钻头（SS WHITE，目录号：14002-5）
灌注盘（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：11469）
无菌瓢（精细科学工具，目录号：10090-13）
称重秤（Kent Scientific，目录号：SCL-1015）
电动剃须刀，迷你无线修剪器（Braintree Scientific，目录号：CLP-9868）
动物麻醉系统（哈佛仪器，目录号：72-6467）
麻醉诱导室（Smiths Medical，目录号：V711801）
立体定向框架（KOPF INSTRUMENTS，型号：963型标准配件）
手术钻 - TCM Endo III（Nouvag，产品目录号：31817）
激光532 nm（Laserglow Technologies，型号：LCS-0532，电源，Laserglow Technologies，型号：C5310051X，带Thorlabs介质镜聚焦激光器，Thorlabs，产品目录号：CM1-E02）
激光护目镜（Laserglow Technologies，目录号：AGF5565XX）
数字周星蠕动泵（世界精密仪器公司，产品目录号：PERIPRO-4HS）
低温恒温器（Leica，型号：CM3050 S Research Cryostat）
徕卡HCX PL APO L 10x 1.0NA水再现物镜
Leica SP5共聚焦显微镜（Leica，型号：Leica SP5）
动物手术体视显微镜（徕卡，M系列）
倒置显微镜（徕卡，型号：徕卡DMI6000B）

软件

徕卡LAS AF软件
ImageJ
通过Graph Pad vs9的棱镜

程序

溶液准备
1. 在开始手术前，将孟加拉玫瑰红溶液（配方1）置于无菌生理盐水中100 mg / ml。
  注意：确保溶液不会暴露在光线下，并且在储存期间或制作溶液时粉末不会暴露在光线下。注射前应将玫瑰孟加拉溶液制成新鲜。
麻醉和手术准备
1. 称动物并记录体重。
2. 将一只老鼠放入麻醉诱导室。
3. 调整氧气流速至1.5 L / min，并将异氟醚蒸发器调整至3％，在2分钟内将异氟醚逐渐增加至5％。
4. 一旦动物失去正确的反射，停止气体流入室。
5. 快速将大鼠从诱导室中取出并放入麻醉面罩或鼻锥中。
6. 立即将流量重定向至麻醉剂鼻锥，将氧气流速降至0.3-0.4 L / min，然后将氮气流量计设置为0.6-0.08 L / min，并将异氟醚降低至1.5-2.0％。
  注：我们使用1.5-2.0％异氟醚（70％氧化亚氮和30％氧气），流量为1 L / min，以保持500 g大鼠的麻醉平面。
  吸氧和血管收缩可以改变诱发中风的大小，因此麻醉和吸入气体的选择在诱发中风时很重要。
7. 根据IACUC协议，确保动物处于麻醉的手术平面，如反射消失，肌肉松弛和深度有节奏的呼吸。
8. 使用直肠温度探头和加热垫确保体温保持在37°C。
9. 在两只眼睛上涂抹眼药膏以防止损伤角膜，并且每15分钟或根据需要重新涂抹。
10. 用一把无菌外科剪刀在皮肤旁边的根部切割头发，将头发从大鼠头皮上的手术区域从耳朵移至眼睛，或者用电动剃须刀刮毛。
11. 用Betadine ®手术磨砂准备皮肤。
头骨的薄窗
1. 将动物装到立体定位装置上（图1A）。
2. 首先将一个护耳放入耳道并拧紧，然后将另一个护耳滑入耳道，直至头部不能再从左向右移动。将第二个耳杆拧紧到位（图1B和1C）。
  注意：如果头部不从左向右移动，则耳条已正确放置。
3. 将前牙或咬合棒固定在老鼠的嘴中。调整咬合杆直到头部水平。大鼠被适当地固定在立体定位仪器中，然后在施加压力时头部不会朝任何方向移动（图1D）。
  注意：正确放置大鼠在立体定位框架中是至关重要的，因为钻孔和头骨变薄需要头部没有移动。
  
  图1.鼠标在立体定位手术设备中的安装A.啮齿动物的标准立体定位头框，带有可调整的耳栏和咬合杆上的麻醉鼻锥。 B.大鼠以固定的耳条安装在立体框架中。 C.正确放置鼠标头在立体框架中，使得头部如图中红色虚线所示位于框架中央。 D.正确调整鼻锥和咬合杆高度，以确保头骨水平，如黄色虚线所示。
4. 将动物手术体视显微镜下的手术区域集中在5x。
5. 使用0.25％布比卡因诱导切口线块（不超过8 mg / kg）。
6. 在头骨中线上做一个1厘米的切口（图2A），优于耳朵，低于眼睛。
7. 通过将切口的每一侧从中线缩回来暴露头骨。
8. 如果您在前囟点轻轻地推动颅骨板，并且缝线在轻微压力下移动时会变得明显，则现在可以轻松定位Bregma（图2B）。
9. （0,0）：（1,3），（1，-1），（4,3）和（4），在以下点标记优选的前肢感觉运动皮层（图2C）的立体定位坐标，-1）
10. 在标记的坐标（图2D和2E），1-4mm侧面之间的矩形中稀释头骨; -1到+3毫米前囟，使用手术钻与牙髓电子马达系统设置为5000转的速度，配备了一个牙科手机配备和圆形硬质合金钻头设计用于切割。颅骨应该在3×4mm区域内均匀地变薄至0.1mm的厚度。
  注：颅骨变薄下的血管应清晰可见。如果您无法清楚地看到下面的脉管系统，可尝试在窗口上添加一滴无菌生理盐水以清除钻孔过程中产生的任何微粒的窗口。如果在添加一滴盐水后，基础血管不可见，则需要进一步稀释，继续稀释颅骨，直至血管变得可见。＆nbsp;
  
  图2.大鼠感觉运动皮层的光血栓形成A.中立切口暴露颅骨（用红色虚线表示）位于立体定位框架中的大鼠。 B.手术暴露的颅骨; C.使用手术显微镜（5倍放大率）相对于前囟（用黄色圆圈标记）建立的黑色圆圈标记的薄窗口角的立体坐标。 D.头骨的薄窗口（用黑框表示）在概述的坐标之间创建; C.在变薄的颅骨下的血管在放大5倍时变得可见; E.F。将激光靶向（用绿色圆圈表示）到薄窗口正下方的血管以诱导感觉运动皮质的缺血性梗塞，以5x放大倍数显示; G.
尾静脉注射光敏染料
1. 按照30mg / kg的浓度计算注射所需的玫瑰红（在手术步骤A1之前制备）的体积：
2. 用温水擦拭鼠尾以增加静脉的可见度（图3A和3B）。
3. 用非优势手阻塞静脉（图3C）。
4. 将针头滑入尾静脉，斜面朝上，针头平行于静脉（图3D和3E）。
5. 血液闪光表明导管处于正确位置（图3F）。
6. 将导管滑入静脉并取出针（图3G）。
7. 确保有血液流出导管（图3F）。
8. 用玫瑰红加上针。
9. 注入孟加拉玫瑰红的计算体积（D1），速率为1毫升/分钟。
10. 用0.2ml无菌盐水冲洗导管。
  注：玫瑰红可在注射后进入血管周围空间，导致尾静脉局部缺血并随后出现坏死性细胞死亡，盐水冲洗可预防此并发症。
  
  图3.大鼠尾静脉注射A.大鼠尾静脉的位置标有红色虚线。 B.将鼠尾旋转90°，使尾静脉变得可见。 C.用非优势手阻塞静脉。 D.使斜面朝上使导管针与尾静脉对齐。 E.将针平行于静脉。 F.插入针头，直到导管中有可见的血迹。 G.取出静脉留置导管的针头。 H.检查以确保血液流出导管以确保正确放置。导管现在准备好注射。 I.注射后取出导管。 J.施加压力使凝块形成。 K.确保尾巴看起来健康并且血流已经返回到尾尖。
诱导光血栓形成
1. 戴上激光防护眼镜。
2. 使用准直的绿色激光束（532nm，17mW;〜4.0mm光束直径）立即照亮体感皮层上的变薄的头骨15分钟以光激活玫瑰红（图2F和2G），遮蔽所有照亮的皮质脉管系统并诱发局灶性缺血性梗塞。
  注意：激光束位置的精确大小和位置将决定光凝血性中风的大小和位置。在尾静脉注射冲洗（步骤D3）之后立即打开激光束，因为假手术动物遵循所有的概述步骤，但是在15分钟曝光时间段内不打开激光（跳过步骤E2）。 /
3. 在激光曝光器15分钟后，缝合颅骨并根据IACUC方案（0.05mg / kg皮下丁丙诺啡）给予止痛护理。
4. 去除尾静脉导管。
5. 皮下注射3毫升无菌生理盐水以防止脱水。
6. 手术后恢复活动力时，观察动物与受伤皮层相关的前肢瘫痪和虚弱的迹象。
  注：手术后应立即在受伤肢体中出现明显缺陷。在大多数情况下，大鼠通过抬起并握紧受伤爪子避免使用中风前爪，而只使用未受伤前爪支撑体重，这一点很明显。
大鼠心脏灌注
1. 准备灌注解决方案（4％福尔马林和含肝素盐水），并留出时间以达到正确的使用温度（方案2）。
  注：见Gage et al。（2012年）的啮齿动物灌注详细协议。
2. 根据美国兽医协会安乐死指南，以150 mg / kg腹腔注射戊巴比妥钠。
  注：对于500克大鼠，将计算待注射的Euthasol（400mg / ml戊巴比妥钠）的体积如下所示：
  
  500克大鼠的实例：将大鼠重量转化为千克：500克= 0.50千克。确定以毫克戊巴比妥钠注射的质量：0.500千克×150毫克/千克= 75毫克。确定Euthasol注射剂的体积（400 mg / ml）：75 mg / 400 mg / ml = 0.188 ml 。
3. 等待手术飞机到达，然后将动物背部固定在85°的灌注托盘上（图4A）。
4. 定位剑突下面的剑突过程，在肋骨下面穿过覆盖物和腹壁进行横向切口。
5. 使用钝头剪刀在膈肌上切开一个切口，沿着整个胸腔继续切口，露出胸膜腔。
6. 通过肋骨两侧做矢状切口，确保不会损伤心脏或肺部。
7. 提起并固定肋骨以显露冠状胸腔并释放胸腔附件的心脏（图4B）。
8. 使用止血钳，握住心脏的顶端，并通过左心尖插入钝头16号针头，继续插入左心室（图4C）。
  注意：确保针头不会伸出主动脉弓很重要。
9. 在右心房做一个小切口，释放液体压力，并以70-100 ml / min的速度启动启动的蠕动灌注泵（图4D）。
10. 灌注250毫升37℃等渗盐水（细胞）肝素（5,000 IU / L）溶液（方案3）以清除动物的所有血液。
  注意：动物应该变得苍白，肝脏应该是白色的，并且在成功灌注时只有清澈的液体应该从右心房排出。
11. 在4℃将灌注液转换为4％福尔马林溶液，再以70-100ml / min的速率灌注250ml溶液。
  注意：在4％福尔马林溶液输注后的几秒钟内，固定震颤应开始发生在整个大鼠身上，大鼠在灌注结束时应该非常僵硬。
  
  图4.经颅灌注大鼠A.大鼠置于85°灌注托盘上，虚线表示切口的位置。 B.手术暴露的冠状胸部，心脏突出。 C.通过心脏的左心尖插入钝头16号针头。 D.切入右心房释放液体压力并排出灌注液。
大鼠脑的集合
1. 将颈部脊髓（C1）和头骨之间的动物斩首。
2. 创建一个跨越颅骨的中线切口并移除所有皮肤以显露整个头骨。
3. 将一个咬骨钳插入颈椎脱落后沿枕骨头滑动的空隙中。
4. 切开枕骨颅骨，将骨头从后脑拉开，在另一侧重复。
5. 沿中线在颅骨下方插入钝头剪刀，在中线剪下颅骨。
6. 剥离颅骨的每一半远离大脑。
7. 当大脑现在准备好从开放的颅骨腔体中移出时，可以夹住任何尖锐的边缘。
8. 在额叶和嗅球之间插入一个小勺，释放大脑中的大脑。
9. 运行大脑下的勺子，直到所有连接的组织血管被清除，并且大脑容易从开放的颅骨滑出。
组织固定，冷冻和冷冻切片
1. 取出后立即将大脑置于50毫升4％福尔马林中，在4℃下放置过夜。
2. 过夜固定后，用4°C 50毫升30％蔗糖溶液（配方4）替换4％福尔马林，并在4°C下离开组织3-4天，直到大脑不再浮于溶液中。
3. 。从溶液中取出组织（组织会僵硬，白色）。
4. 用一层OCT冷冻介质覆盖大脑
5. 将大脑浸入冷却至-50℃的2-甲基丁烷溶液中。
6. 让大脑淹没1分钟，以确保大脑整个冻结。
  注意：如果整个大脑长时间存放（超过2周），大脑应该涂上一层额外的OCT冷冻介质。
7. 组织现在可以在-20°C长时间储存或立即冷冻切片。
  注意：如果计划对组织进行切片，我们不建议在-80°C下储存，因为组织切片时必须加热至-20°C。当我们在-80°C下储存后，将组织温热至最佳切片温度时，我们经历了组织的破裂和冻融线的出现。
8. 一个低温恒温器应设置在-19°C和-22°C之间的温度，对于冠状脑切片，切割厚度为20μm。
9. 切开整个大脑并将所有切片放在玻璃显微镜载玻片上。
  注意：如果进行免疫化学分析，建议使用Gold幻灯片，因为我们发现切片不能很好地粘附在未涂布的幻灯片上烘烤后。
10. 幻灯片现在可以被复染或免疫标记。
中风病变的显微镜检查
1. 在共聚焦显微镜上选择10倍显微镜物镜。
  注意：我们使用带Leica HCX PL APO L 10x 1.0NA水再现物镜和Leica LAS AF软件的Leica SP5共聚焦显微镜。
2. 中风区域可以通过应用复染色，免疫标记的设置进行可视化，或者在某些情况下，可以使用FITC发射光谱中的自发荧光来有效定义中风边界。在未染色的组织中，可以使用光微分干涉对比或光DIC设置来确定中风边界。
3. 使用显微镜软件设置参数来收集包含整个大脑切片的图像扫描图像（图5A）。
4. 收集横跨梗塞的每个脑切片的图像（图5B）。
  
  图5.跨越缺血性梗塞的冠状切片A.大鼠脑的冠状切片，相对于前囟的侧向坐标，梗塞面积以红色显示。 B.对应于（A）中所示的每个冠状切片的行程区域，使用10倍放大倍数的共聚焦显微镜上的FITC发射光谱的光谱设置来可视化。改编自Wiersma 等，2017年。
缺血性病变的体积分析
1. 通过分析横跨缺血性病变的每个冠状切片中的梗塞体积可以确定皮质的中风体积（图5）。
2. 从导入到ImageJ中的每个冠状剖面导入收集的图像（程序I）（图6A）。
3. 使用ImageJ中的测量功能，跟踪每个部分的梗塞，以确定每个切片中的中风的比表面积（图6B）。
4. 将切片深度乘以表面积（20μm）以确定每个切片的损伤体积（图6C）。
  
  图6.一个冠状切片的梗塞体积计算示例A.使用10倍放大倍数的共聚焦显微镜上的FITC发射光谱的光谱设置显示切片中的梗塞清晰可见。 B.在ImageJ中追踪的梗塞区域用白色虚线表示。 C. ImageJ计算（B）所示的梗塞表面积，将其乘以切片厚度以提供切片中的每搏输出量。
5. 每个切片跨越病变的梗塞体积可以相加，以确定总的每搏输出量。
6. 预先确定排除标准并从研究中移除没有最小预定每搏量的动物是非常重要的（参见数据分析）。
局部缺血性梗塞的皮层映射
1. 通过记录跨病变组织的每个冠状切片的中风边界的立体定位坐标，为每只动物创建显示诱发性中风的地形位置的皮层地图。
  对于横跨损伤的每个冠状切片，使用大鼠图谱来确定切片的y坐标（图7A）。
2. 在建立的y坐标确定笔划边界的两个x坐标（图7A）。
3. 绘制网格上的坐标（图7B）。
4. 一旦绘制了所有的点，就可以将它们结合起来以创建中风区域的轮廓（图7C）。
  
  图7.找到中风皮层地形梗塞图的坐标A.冠状切片覆盖在大鼠图谱上以确定笔画的y坐标，然后笔划边界的x坐标为确定为切片（红色圆圈）。 B.边界坐标转移到网格上（红色圆圈）。重复此操作直至输入所有坐标，并在点之间绘制一条线以勾画出笔划边界。 C.网格可以叠加在皮层上以显示中风的位置。改编自Wiersma 等，2017年。
5. 可以通过平均每个笔画边界的y坐标的立体定向x坐标来创建笔画区域的平均地形图，或者可以叠加笔画区域以显示梗塞大小和立体定位的恒定性。
6. 应该预先确定中风的可接受位置，并且应该从研究中删除中风之外的动物（参见数据分析）。

数据分析

光血栓性中风在梗塞的体积和位置上高度一致。我们在雄性Sprague Dawley大鼠中进行n = 52次中风，发现平均中风大小为4.424mm 3，标准偏差为0.316，标准误差为0.0432（图8A）。
我们建议排除每搏量在平均每搏量3个标准偏差之外的动物。
当所有52个脑卒中的地形图表示重叠时，很明显皮层脑卒中的位置非常稳定（图8B）。平均笔划地形图可以通过平均每个点的x和y坐标来创建。我们建议排除在任何位置距离平均坐标2毫米的动物。
当比较不同组之间的中风大小时，我们使用学生的不成对的双尾 t - 测试来确定组之间的中风体积是否显着不同。

图8.脑卒中体积和位置的数据分析A.脑卒中体积为n = 52只动物，其平均值的长边中心线表示均值，标准误差线表示均值。 B.覆盖n = 52个笔划的地形皮层图。改编自Wiersma 等，2017年。

笔记

光血栓形成的中风模型是非常可重复的，因此在我们的研究中给予中风的52只动物中没有一只必须被排除，因为其中风的体积超过平均值3个标准差以上。在我们的研究中接受中风的所有动物显示由于缺血性损伤导致显着的行为缺陷。

食谱

玫瑰孟加拉解决方案
1. 在一个小管里称100毫克的玫瑰红孟加拉
2. 测量1毫升无菌生理盐水
  注意：所有的称重和测量步骤应该在最少的光线下完成。
3. 加入生理盐水至孟加拉玫瑰，剧烈混合至所有玫瑰孟加拉溶液中。
  注：一旦玫瑰红在溶液中，它对光线非常敏感，应避免任何光线照射。
4％福尔马林溶液
1. 测量300毫升等渗盐水
2. 加入200毫升1:10福尔马林溶液
3. 颠倒混合
4. 冷至4°C
等渗盐水肝素（5,000 IU / L）溶液
1. 测量500毫升等渗盐水
2. 温水至37°C
3. 添加2,500 IU肝素
  注意：肝素将在37°C变性超时，直到使用前才添加。
4. 将肝素混入盐水中
30％蔗糖溶液
1. 测量45毫升等渗盐水
2. 加入15克D-蔗糖
3. 大力混合
4. 冷至4°C

致谢

这项工作得到了艾伯塔省创新健康解决方案，加拿大心脏和中风基金会，加拿大卫生研究院和加拿大自然科学和工程研究委员会的支持。来自加拿大创新基金会和艾伯塔省小型设备赠款的赠款用于获取共聚焦显微镜设备。该协议和数据来自以前的工作：Wiersma，A. M.，Fouad，K.和Winship，I. R.（2017）。增强脊柱可塑性放大了康复训练的益处并改善了中风的康复 J Neurosci 37（45）：10983-10997。作者没有利益冲突要申报。

参考

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Carmichael，S.T。（2005）。啮齿动物的中风模型：大小，机制和目的 NeuroRx 2（3）：396-409。
Carmichael，S. T.，Archibeque，I.，Luke，L.，Nolan，T.，Momiy，J。和Li，S。（2005）。中风后的生长相关基因表达：围梗死皮层中生长促进区的证据。 Exp Neurol 193（2）：291-311。
Dietrich，W. D.，Watson，B. D.，Busto，R.，Ginsberg，M. D.（1987）。皮层梗塞后的代谢可塑性：2-脱氧葡萄糖研究。在：Raichel，M. E.和Powers，W. J.（Eds）中。脑血管疾病。
Gage，G.J.，Kipke，D.R。和Shain，W。（2012）。啮齿动物全动物灌注固定 Vis Exp （65）。
Ikeda，S.，Harada，K.，Ohwatashi，A.，Kamikawa，Y.，Yoshida，A。和Kawahira，K。（2013）。光化学诱导脑梗塞的新型非人灵长类动物模型 PLoS一个 8（3）：e60037。
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