材料和试剂

移液器吸头
2毫升试管（赛普拉斯，中国）
10毫升锥形管（康健，中国）
1毫升注射器（中国建始）
注射器膜过滤器，0.22微米（金腾，中国）
Synechocystis sp。 PCC 6803（Tan等人，2011）
Milli-Q水（德国Millipore）
玻璃珠（Sigma-Aldrich，目录号：G9018-250G）
果糖标准品（国药集团化学试剂，目录号：63003034）
葡萄糖标准品（国药集团化学试剂，目录号：10010518）
液氮
200mM NaOH（用Milli-Q水制备）
蔗糖（国药集团化学试剂，目录号：10021418）
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O）（国药集团化学试剂，目录号：10013018）
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（国药集团化学试剂有限公司，产品目录号：20011160）
批号酸一水合物（C 6 H 8 O 7·H 2 O）（国药集团化学试剂，目录号：10007118）
柠檬酸铁铵（（NH 4）3 FeCl 2·2H 2 O·14 O 14， / C 6 H 8 O 7·xFe 3·yNH 3）（（1）国药集团化学试剂，目录号：30011428）
EDTA·2Na·2H 2 O（国药集团化学试剂，目录号：10009717）
碳酸钠（Na 2 CO 3）（国药集团化学试剂，目录号：10019260）
硼酸（H 3 BO 3）（Sinopharm Chemical Reagent，目录号：10004818）
氯化锰（II）四水合物（MnCl 2·4H 2 O）（国药集团化学试剂，目录号：20026118）
硫酸锌七水合物（ZnSO 4·7H 2 O）（国药集团化学试剂，目录号：10024018）
钼酸钠二水合物（Na 2 MoO 4·2H 2 O）（国药集团化学试剂，目录号：10019818）
五水合硫酸铜（II）（CuSO 4·5H 2 O）（国药集团化学试剂，产品目录号：10008218）
氯化钴（II）六水合物（CoCl 2·6H 2 O）（国药集团化学试剂，产品目录号：10007216）
硝酸钠（NaNO 3）（国药集团化学试剂，目录号：10019918）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（国药集团化学试剂，目录号：10017618）
磷酸氢二钾三水合物（KH 2 HPO 4·3H 2 O）（国药集团化学试剂，目录号：10017518）
苯基甲磺酰氟（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
异丙醇（国药集团化学试剂，目录号：40064360）
BG11中（见食谱）
100 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0）（见食谱）
100毫米PMSF（见食谱）

设备

50毫升烧瓶
移液器（Eppendorf，德国）
摇床（太仓华美，型号：THZ-701B）
水浴（上海亚龙，型号：B-260）
离心机（Beckman Coulter，型号：Microfuge®22R）
-20°C冰箱（海尔，型号：BCD-219D）
Vortex-Genie 2（Scientific Industries，型号：Vortex-Genie 2）
用于PCR的热循环仪（Bio-Rad Laboratories，型号：T-100）
离子色谱法（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Dionex TM ICS-5000 +）
Dionex TM CarboPac TM PA10分析柱（4×250mm，Thermo Fisher Scientific，型号：Dionex TM TM CarboPac TM TM > PA10）

软件

Chromeleon TM软件（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM TM 6.80;产品目录号：CHROMELEON6）

程序

Synechocystis sp。的培养PCC 6803（Tan等人，2011）
注意：通过用分光光度计测量730nm处的光密度（OD）来监测蓝细菌细胞的生长。在50ml烧瓶中培养体积应小于30ml。
1. 在20ml液体BG-11培养基（参见配方1）中于50ml烧瓶中培养集胞藻（Synechocystis）细胞，其初始OD 730值为0.05。
2. 在30℃摇动（150rpm）和恒定的白光照度（50μE/ m 2 /秒）培养集胞藻培养物约4天达到指数成长阶段。
从集胞蓝细胞制备细胞粗提物
1. 通过在室温下以8,000×gg离心10分钟收集8ml的集胞蓝细菌的对数期培养物（OD 730≤2）。
2. 在2ml管中的0.5ml 100mM磷酸钾缓冲液（pH7.0）中重悬集胞藻细胞。
3. 加入1克玻璃珠（150-212微米;西格玛奥德里奇公司）到2毫升含有细胞悬液和100毫米苯甲磺酰氟（PMSF）的试管中，使终浓度达到1毫米。然后，以最高速度涡旋管1分钟。每10秒涡旋一次，将试管在冰上冷却5秒。
4. 在12,000×gg，4℃离心30分钟后，将上清液转移到新管中并在使用前储存在冰上。
  注意：应立即使用细胞粗提取物。
检测体外转化酶活性
1. 对于50μl体外转化酶反应，将磷酸钾缓冲液（pH7.0），蔗糖和粗提物混合在一起（磷酸钾和蔗糖的最终浓度分别为100mM和2g / L，粗提物的蛋白质浓度为2.5〜4.0 g / L。）使用不含细胞粗提物的反应混合物作为阴性对照。
2. 在热循环仪（T100，Bio-Rad，USA）中于30℃孵育混合物1.5小时。然后，停止反应三次冻融循环。在每个冻融循环中，将反应混合物在液氮中冷冻，然后通过在65℃水浴中孵育解冻。使用离子色谱法测量所得葡萄糖和果糖以及其余蔗糖底物的量（图1）。
3. 将反应混合物在12,000×gg下旋转10秒。然后，将25μl稀释的混合物置于配备有电化学检测器和Dionex TM CarboPac TM的ICS-5000 +离子交换色谱系统中， > PA10分析柱（4×250mm，ThermoFisher，Waltham，MA，USA）。
  用200 mM NaOH以1.0 ml / min的流速洗脱色谱柱注意：反应混合物应稀释至少50倍，然后用离子色谱分析。
4. 准备一系列葡萄糖标准溶液（0.01,0.05,0.1,0.5,1,2 mg / L），使用离子色谱法建立标准曲线（见下文）。
定量葡萄糖由蔗糖降解转化酶催化
1. 使用上述方法保留葡萄糖和果糖的时间分别为3.5和3.8分钟（图1）
2. 使用Chromeleon软件计算的峰面积建立葡萄糖标准曲线（图2）。
  
  图1.标准品和体外转化酶反应混合物的离子色谱图。A.葡萄糖 - 果糖标准混合物的色谱图。将100mg / L的葡萄糖和果糖标准混合在一起并通过离子色谱分析。 B.不含细胞粗提物的体外转化酶反应混合物的色谱图（阴性对照）。 C.体外转化酶反应混合物的色谱图。 Glu，葡萄糖; Fru，果糖; Suc，蔗糖。
3. 为了定量反应混合物中的葡萄糖，计算Chromeleon软件通过离子色谱法得到的目标峰面积，然后使用葡萄糖标准品的标准曲线确定葡萄糖浓度（图2）。
  
  图2.葡萄糖标准曲线

数据分析

根据等式计算体外转化酶活性：

转化酶活性[nmol葡萄糖/分钟/ mg蛋白质] = C葡萄糖×D / MW葡萄糖/ RT / C蛋白质

其中C葡萄糖，由转化酶反应产生的葡萄糖，单位：nmol / L;
D，细胞粗提物的稀释比例，即在该方案中为50;
MW gluose ，葡萄糖的分子量，即180;
RT，反应时间，即本协议中的90分钟;
蛋白质浓度，细胞粗提物的蛋白质浓度，单位：毫克/升。

食谱

BG11培养基（Rippka等人，1979）
1. 如下准备了8种10x股票：
  库存1（40克/升K 2 HPO 4·3H 2 O）
  库存2（75g / L MgSO 4·7H 2 O）
  库存3（36克/升CaCl 2·2H 2 O）
  库存4（6克/升批发酸）
  库存5（6克/升柠檬酸铁铵）
  储备液6（1g / L EDTA·2Na·2H2O）
  库存7（20g / L Na 2 CO 3）
  库存A5（2.86g / LH 3 BO 3，1.81g / L MnCl 2·4H 2 O， 0.22g / L ZnSO 4·7H 2 O，0.39g / L NaMoO 4·2H 2 O， 0.08mg / L CuSO 4·5H 2 O，0.01g / L CoCl 2·6H 2 O）
  高压灭菌器1和5在121°C下保持20分钟。
  
  使用前将储存在4℃的高压灭菌的股票和其他股票存储
2. 在992ml ddH 2 O中溶解1.5g NaNO 3，向培养基中加入1ml储备液2,3,4,6,7和A5。将培养基在121°C高压灭菌20分钟，并补充1毫升股票1和5
100mM磷酸钾缓冲液（pH7.0）
1. 通过将45.6g K 2 HPO 4·3H 2 O溶解于水中，制备0.2MK 2 HPO 4溶液。在ddH <2> O中调整音量并将音量调整为1L
2. 通过在ddH 2中溶解27.2g KH 2 PO 4来制备0.2M KH 2 PO 4溶液将音量调节至1L
3. 通过混合38ml的0.2M KH 2 PO 4溶液，62ml的0.2M KH 2 O 2溶液来制备100mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0） > PO 4溶液和100ml ddH 2 O
100毫摩尔PMSF
将0.174克PMSF溶解于10毫升异丙醇中，并在使用前储存于-20°C

致谢

这项工作得到了中国杰出青年科学基金（31525002至X.鲁），山东省重点基础研究项目（ZR2017ZB0211），中德联合研究项目（授予GZ 984至X. Lu），中国科学院国家科学基金（31301018），中国科学院重点研究计划项目（ZDRW-ZS-2016-3至X.Tan），青岛创新领先企业山东泰山奖学金天赋（15-10-3-15-（31）-zch）。

参考

Curatti，L.，Giarrocco，L.E。，Cumino，A.C。和Salerno，G.L。（2008）。蔗糖合成酶参与蔗糖转化为丝状固氮蓝藻中的多糖。 Planta 228（4）：617-625。
Du，W.，Liang，F.，Duan，Y.，Tan，X.和Lu，X.（2013）。探索蓝藻对蔗糖的光合生产能力 Metab Eng 19：17-25。
Kolman，M.A.，Nishi，C.N.，Perez-Cenci，M.and Salerno，G.L。（2015）。蓝藻中的蔗糖：来自盐分应答分子，在氮固定中发挥关键作用。 a> Life（Basel） 5（1）：102-126。
Rippka，R.，Deruelles，J.，Waterbury，J.B.，Herdman，M.，Stanier，R.Y。（1979）。蓝藻纯培养物的一般分配，菌株历史和特性。
Tan，X.，Yao，L.，Gao，Q.，Wang，W.，Qi，F。和Lu，X.（2011）。光合作用驱动的二氧化碳转化为蓝细菌中的脂肪醇和碳氢化合物 Metab Eng 13（2）：169-176。
Tan，X.，Du，W.和Lu，X.（2015）。通过基因工程和凝胶包裹的蓝细菌产生葡萄糖基甘油的光合和细胞外生产 Appl Microbiol Biotechnol 99（5）：2147-2154。
Vargas，W.，Cumino，A.和Salerno，G.L。（2003）。蓝藻碱性/中性转化酶。植物细胞质中蔗糖水解的起源？植物细胞216（6）：951-960。
Vargas，W.A。和Salerno，G.L.（2010）。灰姑娘的蔗糖水解故事：碱性/中性转化酶，从蓝藻到植物细胞质中不可预见的作用和细胞器。植物科学 178（1）：1-8。