材料和试剂

15厘米培养板（Corning，Falcon ，目录号：353025）
15毫升Falcon管（Corning，Falcon ，目录号：352097）
96孔V底板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：249570）
平底96孔板（Corning，Falcon ，产品目录号：353072）
50ml Falcon管（Corning，Falcon ，目录号：352098）
血清移液器（Fisher Scientific，目录号：13-678-11）
不透明Eppendorf管（CELLTREAT科学产品，目录号：229437）
Eppendorf管（Fisher Scientific，目录号：05-408-129）
移液器吸头
巴斯德吸管（Fisher Scientific，目录号：13-678-8B）
100μm细胞过滤器（Corning，Falcon ，目录号：352360）
0.20μm过滤器（Corning，目录号：431229）
MS5（Lee等人，2015a和2015b）
OP9（Lee等人，2015a和2017）
（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：10977023）。
胰蛋白酶（康宁，目录号：25-052-CI）
台盼蓝（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15250061）
70％乙醇
Ficoll-Paque Plus（GE Healthcare，目录号：17144002）
抗人CD34 MACS微珠（Miltenyi Biotec，目录号：130-046-702）
重组人Flt3L（Celldex Therapeutics，目录号：CDX-301）
重组人SCF（PeproTech，目录号：300-07）
重组人GM-CSF（PeproTech，目录号：300-03）
抗体（克隆名称，荧光染料，生产商和稀释度的详细信息列在表1和表3中）
含有脱氧核糖核苷的MEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：12571071）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10437028）
Pen-Strep（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
丝裂霉素C（Sigma-Aldrich，目录号：M4287-5X2MG）
Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（GE Healthcare，目录号：SH30378.02）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Corning，目录号：46-034-CI）
牛血清白蛋白（BSA）（ThermoFisher，目录号：BP1600-100）
FcR封闭缓冲液（Miltenyi Biotec，目录号：130-059-901）
CountBright Absolute Counting Beads（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：C36950）
完整的MEMα培养基（见食谱）
丝裂霉素C储备（1毫克/毫升）（见食谱）
FACS缓冲液（见食谱）
抗CD34微珠/ FcR阻断混合物（见食谱）

设备

移液器
孵化器（Forma Scientific，型号：3354）
离心机（Eppendorf，型号：5810 R，目录号：5811000320）
用通用支架涡旋（VWR，目录号：97043-562）
显微镜
流式细胞仪（BD，型号：BD LSRII或LSRFortessa TM）

程序

基质细胞培养（第-4天 - 第0天）
1. 传代基质细胞（最多13次）
  1. 在完全MEMα培养基中培养MS5和OP9细胞。对于15厘米平板，在20毫升培养基中种植150万个细胞。
  2. 对于正常通道，显微镜检查细胞是80-90％汇合。
  3. 通过抽吸从培养板中除去培养基，用10ml无菌PBS清洗细胞以除去培养基和FBS。
  4. 取出PBS，然后加入3 ml预热至37°C的胰蛋白酶。
  5. 在37°C孵育2-3分钟，显微镜检查细胞已经开始分离。
  6. 加入10 ml完全MEMα培养基预热至37°C停止胰蛋白酶活性
  7. 通过上下移液重悬细胞，然后将细胞转移到15 ml收集管中。
  8. 在4℃下以450×g（1,500rpm）离心5分钟。
  9. 除去上清液，然后将细胞重悬于1ml完全MEMα培养基中。（细胞浓缩）
  10. 在新的15厘米板中，加入20毫升完整的MEMα培养基。将100μl细胞浓缩液转移到新的平板上。
    这个新盘子在3-4天后会变得融合。
  11. 在37℃，5％CO 2下孵育3-4天，或直到细胞达到80-90％汇合。
  12. 再次通过细胞，最多可以传代13次。
  13. 对于MS5和OP9细胞，具有80-90％汇合度的15cm平板的细胞产量是15-20万个细胞。
2. 用丝裂霉素C处理基质细胞
  1. 确认MS5 / OP9细胞是80-90％汇合。
  2. 标签收集管（'MS5 + mitC'，'OP9 + mitC'）。
  3. 直接将丝裂霉素C贮存液（1mg / ml，100x）加入培养基中以达到10μg/ ml的终浓度。例如，吸出培养基并加回10毫升，然后加入100微升丝裂霉素C原液。
  4. 轻轻旋转混合3-5秒。
  5. 在37°C孵育3小时。
3. 电镀基质细胞
  1. 取出培养基，然后加入10 ml PBS。轻轻旋转盘子3-5秒。
  2. 取出PBS，然后加入3毫升胰蛋白酶。
  3. 在37°C孵育2-3分钟，并使用显微镜确认细胞已经开始分离。
  4. 加入10ml完整的MEMα培养基以终止胰蛋白酶。
  5. 通过上下移液重悬细胞，然后将细胞转移到标记的收获管中。
  6. 在450℃下离心5分钟4分钟。
  7. 移除培养基，然后重悬于1ml完全MEMα培养基中。
  8. 计数细胞，并计算最终电镀所需细胞的数量和体积。平底96孔板中的每个孔应在50μl完全MEMα培养基中含有6,250个OP9细胞和37,500个MS5细胞。为了准备一块96孔板，在5ml完全MEMα培养基中重悬0.625×10 6个OP9细胞和3.75×10 6个MS5细胞，充分混合，然后分配每孔加入50μl。
  9. 在37°C培养细胞过夜。
  10. 通过在光学显微镜下观察时轻轻摇动，确认细胞牢固地附着在平板上。通过安全连接，细胞不应该随着流体运动而漂移。
  11. 在1-3天内，对这些细胞进行分选和平板祖细胞。
从人脐带血中纯化CD34 +造血干细胞和祖细胞（第0天）
1. 1.使用Ficoll-Paque分离脐血单核细胞
  注意：这个步骤应该在室温下处理。
  1. 添加25毫升PBS到多个50毫升管中。
  2. 用乙醇消毒脐血样本容器的外部。样品通常含有约100毫升的血液。
  3. 以15毫升的份量，将脐血样本均匀分布到准备好的含有PBS的50毫升Falcon管中。
  4. 用一些额外的室温PBS冲洗血液样本容器，并使用冲洗来“倒掉”最后的Falcon管（使得每个管具有40ml的流体体积）。平均每袋脐带血使用7只Falcon管。
  5. 紧密密封每个试管，并轻轻颠倒3-5次以重新悬浮任何沉淀细胞。
  6. 用10ml血清移液管以10.5ml Ficoll-Paque以下述方式置于细胞悬液的下面：
    1. 加入10.5毫升的移液器。
    2. 在不释放任何液体的情况下，轻轻地将移液管放在管的底部。
    3. 对于第一个2毫升，非常缓慢地释放Ficoll-Paque到管底部。我们的目标是在管子的底部涂上一层Ficoll-Paque。
    4. 对于接下来的8毫升，Ficoll-Paque释放可以稍微加快，但要小心避免可能扰乱Ficoll-Paque血液界限的湍流。
    5. 最后0.5 ml，减慢Ficoll-Paque释放，并观察吸管中的弯月面。请小心，以防止将气泡引入Ficoll-Paque。
  7. 在室温下450×g（1,500rpm）离心25分钟。使用较低的加速度（9级中的3级）并且没有制动器用于减速。将试管表面的不透明部分朝向离心机的中心马达定位，以便细胞沉积物将聚集在试管的透明部分上，远离马达，因此可以很容易地观察到。
  8. 离心后，应该有四层：
    1. 最上层（黄色/透明，约35毫升）是PBS /血清混合物。
    2. 上面的第二层（混浊，约1毫升）是含白细胞的血沉棕黄层
    3. 从顶部开始的第三层（透明，约10毫升）含有Ficoll-Paque。
    4. 最底层（红色，约5毫升）含有红细胞。
    5. 另外，在血沉棕黄层上，应该在试管壁上沉积一层细胞（多云，〜1mm）的污迹颗粒。
  9. 将收集的细胞转移到buffy收集管中：
    1. 从前面的步骤中为每个50 ml试管准备一个15 ml的buffy收集管。每管加入2 ml PBS。
    2. 除去PBS /血清层直到剩下10毫升的这一层，小心避免从层的顶部吸入湍流。（即，如果血沉棕黄层线在30毫升线上，则保留40毫升总体流体）。
    3. 使用10 ml血清移液管，将血沉棕黄层转移至血沉棕黄色采集管，并小心使流体转移最小化。为此，请将移液器尖端直接放在血沉棕黄层上方，然后缓慢抽吸，然后将液体喷射到血沉棕黄色采集管。
      留下约5毫升PBS /血清用于下一步
    4. 轻轻地摇动管子，重新悬浮Ficoll-Paque中的细胞涂抹的小球，小心避免混合流体层。摇摆运动允许Ficoll-Paque和PBS /血清混合物之间的液 - 液界面将颗粒从墙上刮下。
    5. 尽可能多地将Ficoll-Paque层转移到buffy采集管，同时完全避免RBC层。避免PBS /血清层是理想的，但不是关键。
  10. 在450℃下离心450分钟（1,500rpm）10分钟。
  11. 取出上清液，并将细胞重悬于1ml FACS缓冲液中。
  12. 从所有收集管收集细胞悬液到一个50毫升Falcon管中。
  13. 通过加入FACS缓冲液清洗细胞，直到总流体体积为50毫升。
  14. 计数细胞。每袋脐血产生约300-1,000万个细胞。
  15. 在450℃下离心5分钟4分钟。
  16. 去除上清液，得到单核细胞颗粒。
2. 富集CD34 +细胞＆nbsp;
  1. 准备抗CD34微珠/ FcR阻断混合物。
  2. 在15ml锥形管中，将细胞稀释成每1百万有核细胞2μl抗-CD34微珠/ FcR阻断混合物。
  3. 4°C孵育30-40分钟
  4. 添加FACS缓冲液至15 ml生产线
  5. 在4℃下以450×g（1,500rpm）离心5分钟。
  6. 去除上清液。
  7. 在FACS缓冲液中重悬细胞（每1亿脐血单核细胞1ml）。
  8. 准备洗脱管：15毫升Falcon管+ 2毫升FACS缓冲液。
  9. 用LS MACS柱对CD34 +细胞进行正向选择：
    1. 在柱子顶部放置一个100μm的细胞过滤器。
    2. 通过过滤器过滤5ml FACS缓冲液以平衡柱子;丢弃流通。
    3. 轻轻旋转细胞以确保悬浮。
    4. 通过LS MACS列过滤单元格;保留流通。
    5. 可选：将4 ml FACS缓冲液通过柱子，洗涤柱子一次;放弃这种洗涤。然后，重新加载柱上前一步的流通量以增加电池产量。
    6. 通过4毫升FACS缓冲液洗涤柱子;丢弃洗涤物。再次重复洗涤，再次丢弃洗涤液。
    7. 从磁力架上取下MACS柱，并将其放在洗脱管的顶部。
    8. 将4 ml FACS缓冲液加入色谱柱，并进行重力洗脱。
    9. 加入4 ml FACS缓冲液，小心避免柱子变干，并使用活塞推动FACS缓冲液。
  10. 计数细胞。每袋脐带血产生300-1,000×10 6个CD34 +细胞。
  11. 在450℃下离心5分钟4分钟。
  12. 去除上清液。
  13. （可选）如有必要，细胞可以在4°C的冰上放置过夜，或在10％DMSO + FBS培养基中冷冻;然而，建议在不进行中间冷冻步骤的情况下进行新鲜细胞以避免影响克隆输出和细胞活力。
纯细胞在单细胞环境中培养（第0-7天）
1. 单细胞分选和电镀
  1. 用抗体混合物染色CD34 + HSPC。根据以下稀释度，使用10μl抗体混合物用于1×10 6个细胞（表1）：
    
    表1.用于从人脐带血纯化祖细胞的抗体制备
  2. 在冰上孵育细胞40分钟，并使用流式细胞术，根据以下门控对细胞进行分选（表2，图1）：＆nbsp;
    
    表2.人脐血中祖细胞群的特征
    
    图1.人脐血中祖细胞群的视觉门控策略流式细胞术图显示CD34 + /脐带血细胞分离为10个群体，HSC，MPP，LMPP，MLP ，BNKP，CMP，MEP，GMDP，MDP和CDP。
  3. 将单细胞分入含有基质细胞的96孔板的每个孔中，每孔含50μl完全MEMα培养基。
2. 随时间推移的细胞培养
  1. 在完全培养基中制备2倍细胞因子混合物：
    1. 100 ng / ml Flt3L（最终1x浓度50 ng / ml）。
    2. 20 ng / ml SCF（最终1x浓度10 ng / ml）。
    3. 10ng / ml GM-CSF（最终1x浓度5ng / ml）（不需要培养细胞;刺激并抑制各种细胞亚型的增殖）。
  2. 添加2倍的细胞因子混合物到种子基质细胞孔。（为96孔板加50μl）
  3. 每7天用细胞因子补充培养基。
    1. 在第7天，为每个孔准备50μl含有3倍浓度细胞因子的培养基。
      轻轻地将50μl含3x细胞因子的新鲜培养基通过移液器吸到孔中。＆nbsp;
      注意：制备较高浓度的细胞因子是因为最终的培养基体积会增加，而培养基 - 细胞因子混合物的体积保持不变。由于可能会干扰细胞附着，因此培养基尚未从孔中移除。
    2. 在第14天，如步骤C2c i所示，制备含有3倍浓度的细胞因子的50μl培养基。轻轻地从每个孔中取出50μl旧培养基，然后通过移液器将50μl新鲜培养基加入孔中。
收获和分析细胞（第7〜21天）
1. 通过流式细胞仪读取细胞
  1. 使用以下稀释液在FACS缓冲液中制备抗体混合物（表3）。
    
    表3.用于分析来自人脐带血的后代的抗体制备
  2. 使用多道移液器添加PBS，使得每个孔都被填充。（在96孔板上250μl）
  3. 吸取上下10-20次以重悬细胞，并将150μl转移至96孔V底板进行染色。
  4. 在450℃下离心5分钟4分钟。
  5. 通过微尖抽吸弃去上清液，小心保持液位高于斜井部分。
  6. 将剩余的100μl细胞转移到96孔V底板。
  7. 在450℃下离心4分钟4分钟。
  8. 像以前一样丢弃上清。
  9. 轻轻地旋转平板以重悬细胞，小心避免任何流体溢出。为此，将涡旋速度降至最低，牢牢抓住平板，并将其牢牢放在涡旋混合器上。慢慢地增加涡流速度，并且轻轻地减小涡流混合器上的压力，以便涡流混合器可以振动。然后，降低涡旋速度并取下板。根据需要，这个过程可能会在每个板块的四个象限中重复出现。建议用测试板和自来水练习此技术以确保没有样品损失。（另一种重悬方法是轻轻吸取10-20次。）
  10. 加入4μl抗体。
  11. 像以前一样轻轻地旋转平板以混合细胞与抗体。
  12. 快速旋转离心（50×g，5秒），使细胞和染色混合物下沉至孔底。
  13. 在黑暗中孵育40分钟
  14. 加入200μlPBS清洗。
  15. 在450℃下离心5分钟4分钟。丢弃上清液。
  16. 重悬于50μlFACS缓冲液中。
  17. 漩涡计数珠储备液30秒，并在FACS缓冲液中1:10稀释计数珠。
  18. 每孔加入10μl稀释的计数珠（每孔约1000个珠）。
  19. 在流式细胞仪（BD-LSRII或LSR Fortessa）上获取细胞，并根据以下门控（表4）（图2和Lee等人，2017）获得细胞。
    
    表4.人脐血中子代种群的特征
2. 继续进行数据分析
  
  图2.用于分析人脐带血中后代群体的视觉门控策略流式细胞术图显示了在MP + FSG中培养的与CD34 +细胞分化的6种细胞类型的表型，粒细胞，单核细胞，cDC1，cDC2，pDC和B / NK（淋巴细胞）。

数据分析

数据准备
1. 导出流式细胞术数据并保存在.csv文件中，以便：
  1. 每个数据列都包含一个“维度”数据。
  2. 每行包含一个样本的数据。
  3. 一列'批'存在（区分大小写）;
    来自一位患者的所有样本应该具有相同的批次ID
  4. 一列'祖'存在（区分大小写）。
  5. 所有数据列都是连续的，每个列都包含每个样本子代数据点中相关读数的数量。（图3）
    
    图3.在Excel中查看有效.csv文件的前几行
    示例
R中的数据规范化
1. 在RStudio中打开cPlot.R，然后输入文件。（Code＆gt; Source）（该文件可在 https：/ /github.com/kangliulab/cplot/blob/master/cPlot_v0.7.R。）
2. 将工作目录更改为数据文件的位置。（会话＆gt;设置工作目录＆gt;选择目录）
  注意：不要在同步文件夹（OneDrive，Dropbox等）中使用工作目录，因为这可能会导致文件输出出现问题。
3. 使用以下功能之一对数据进行标准化。要使用，请在控制台中输入函数，将inFile替换为文件名firstData与第一个数据列（最左边的列为＃1），dataCols替换为数据列数。如果需要，关键字可以省略;如果使用，它会将关键字添加到每行的起始处以帮助区分文件。替换单词时，请保留下面标注的任何引号。
  1. addCB（“inFile”，firstData，dataCols，“keyword”）用于必须由主题（ ie ，批处理）和后代（ >即，血统）。
  2. addPatient（“inFile”，firstData，dataCols，“keyword”）用于只能由主题（即，批次）进行归一化的样本。
  3. addPreNorm（“inFile”，firstData，dataCols，“keyword”）用于已经规范化的样本。
  4. 例子：
    1. addCB（“data-file-v123_for-test-use.csv”，5,6）。
    2. addCB（“data-file-v123_for-test-use.csv”，5,6，“v123”）。
4. 使用下面的函数生成t-SNE地图。要使用，请将其输入到控制台中。您可以选择省略所有数字，这会导致脚本使用默认数字（如下所示）。要替换数字，请指明要更改的变量及其新值。
  1. generateManyMaps（dataCols = 6，perVector = c（50），thetaVector = c（0.10），iterVector = c（1000），etaVector = c（200），n = 1，seedSet = FALSE，randSeed = 6）允许同时测试多个参数。它也可以用于通过一组参数生成多个地图。请注意，它会尝试每种可能的参数组合，并会尝试每次组合n次。 dataCols应该等于您的数据列数，perVector选择困惑值，thetaVector选择theta值，iterVector选择迭代运行，etaVector选择eta值，n选择每个参数组合的重复次数，seedSet强制每个plot具有相同的值随机种子和randSeed选择第一个图的随机种子（或者，如果seedSet为TRUE，则所有图的随机种子）。
  2. 例子：
    1. generateManyMaps（）。
    2. generateManyMaps（n = 10，seedSet = TRUE）。
    3. generateManyMaps（perVector = c（40,50,60），etaVector = c（150,200,250），n = 3）。
5. 按顺序使用以下每个函数分配细胞谱系。
  1. pickMap（“inFile”）允许导入一个特定的t-SNE地图用于进一步分析。 inFile应该代表由 generateManyMaps（）创建的数据文件。
  2. assignLineages（）自动为每个数据点计算适当的沿袭轨迹。它只能在pickMap（）被使用后才能使用。可能需要很长时间（3-8小时）才能运行，尤其是对于较大的数据文件！
  3. compileAllData（“inFile”）使用原始数据，标准化数据，tSNE坐标和指定的谱系生成.csv。它假定数据已经被导入到RStudio中。如果在导入数据（步骤3）和这一步之间有一段时间关闭了RStudio，那么您应该在运行compileAllData（）之前重新导入数据。 inFile应该代表由assignLineages（）创建的数据文件。
  4. 例子：
    1. pickMap（“data1_p50_t0.1_s6_i1000.csv”）。
    2. assignLineages（）。
    3. compileAllData（“2assignedLineages_FC0.7.csv”）。

上面，我们描述了我们的数据的概述方法。正如我们在前面的文章中所描述的，每个祖先的输出都被想象成一个6D向量。初步数据清除步骤涉及忽略低细胞计数：对于CDP低于2个细胞，对于所有其他细胞类型低于6个细胞;通过将读数更改为0单元而发生忽视。然后清除数据清理后总共有0个单元输出的祖细胞。细胞类型产量的数据标准化遵循DESeq程序，假设不同供体的单个祖细胞表型的总克隆输出的几何平均值应该相似。细胞类型产量的第二次标准化也通过DESeq进行，以确保所有祖细胞中每种后代类型产量具有相似的几何平均值。
Barnes-Hut t-SNE（Van Der Maaten，2014）被执行以在二维中可视化推断的成对相似性数据。
任何一对细胞之间的效能相似性都是通过它们在这个空间中的接近性使用高斯扩散核来推断的为了给每个祖先分配谱系，我们首先定义六个'骨干';一种用于每种子代产出。每个子代类型的主干由任何具有＆gt;对该后代70％的承诺程度;承诺程度定义为（一个后代类型的产量）/（所有后代类型的总产量）。然后，将每个祖先与任何给定轨迹的距离定义为感兴趣的祖先与该轨迹的所有主干祖先之间的6D欧几里德距离。祖先被分配到与距离最近的轨迹相对应的谱系。

笔记

虽然这种培养方案仅报告了粒细胞，单核细胞，淋巴细胞，CD141 +树突细胞（cDC1），CD1c +树突细胞（cDC2）和浆细胞样树突状细胞（ pDC）造血谱系，该分析方法可以应用于培养不同谱系的任何培养系统，只要细胞输出可以被量化即可。

食谱

完整的MEMα培养基
MEMα
10％FBS
1x Pen / Strep
丝裂霉素C储备液（100x，1mg / ml）
1. 将2毫克丝裂霉素C粉末悬浮于2毫升dH 2 O
  中
2. 涡流解决方案
3. 使用0.20μm过滤器过滤溶液
4. 在-20°C储存长达3个月
FACS缓冲液
DPBS
2 mM EDTA
0.5％BSA
抗CD34微珠/ FcR阻断混合物
每100万个有核细胞准备2μl混合物
15％FcR封闭缓冲液
25％抗CD34 MACS珠
60％FACS缓冲液

致谢

这项工作得到了帝国州干细胞基金通过纽约州卫生部（C029562至K.L.）和美国国家卫生研究院（AI101251和OD023291至K.L.）的支持。在这份手稿中报道的研究部分由哥伦比亚转化免疫学流式细胞术核心中心进行，部分由美国国立卫生研究院院长办公室（S10RR027050和S10OD020056）支持。该协议是从以前的工作Lee等人，2017年，Lee等人，2015a改编的。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。重组人Flt3L是来自Celldex Therapeutics的礼物。

参考

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Levine，JH，Simonds，EF，Bendall，SC，Davis，KL，Amir el，AD，Tadmor，MD，Litvin，O.，Fienberg，HG，Jager，A.，Zunder，ER，Finck，R.，Gedman， AL，Radtke，I.，Downing，JR，Pe'er，D。和Nolan，GP（2015）。数据驱动的AML表型解剖显示与预后相关的祖细胞样细胞。 Cell 162（1）：184-197。
Lee，J.，Zhou，YJ，Ma，W.，Zhang，W.，Aljoufi，A.，Luh，T.，Lucero，K.，Liang，D.，Thomsen，M.，Bhagat，G.，Shen ，Y.和Liu，K。（2017）。人类树突状细胞的谱系特征以造血干细胞和多潜能祖细胞中的IRF8表达为标志。 a> Nat Immunol 18（8）：877-888。
Lee，J.，Breton，G.，Aljoufi，A.，Zhou，Y.J.，Puhr，S.，Nussenzweig，M.C。和Liu，K.（2015a）。使用基质细胞培养的人树突细胞祖细胞的克隆分析 J免疫学方法 425：21-26。
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