材料和试剂

注意：相同的材料和试剂可能被用作替代品。

FnCas12a在E中的表达大肠杆菌Rosetta TM 2（DE3）
1. 100-ml锥形瓶（DWK Life Sciences，DURAN，目录号：21 213 24）
2. 2-L锥形瓶（DWK Life Sciences，DURAN，目录号：21 216 63）
3. 5-L锥形瓶（DWK Life Sciences，DURAN？，目录号：21 216 73）
4. 50-ml锥形离心管（Sigma-Aldrich，目录号：T2318-500EA）
5. 2毫升螺旋顶管（康宁，目录号：430659）
6. 带有密封封闭的Nalgene TM PPCO离心瓶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：3141-0500）或相当的500-ml离心瓶
7. 移液器吸头（DeckWorks TM 标准移液吸头，Corning，目录号：4110; 4112; 4867）
8. 10毫升注射器（BD，目录号：309604）
9. 0.22μm注射器过滤器（Mdi，目录号：SYPL0601MNXX204）
10. 250毫升瓶（Greiner Bio One International，目录号：227261）
11. 大肠杆菌Rosetta TM 2（DE3）细胞（Merck，Novagen，目录号：71400）[编码在lacUV5控制下的T7RNA聚合酶基因] em>启动子]
12. 质粒pDS015 * [pET His6 TEV LIC克隆载体（Addgene，目录号：29653）与F。 novicida U112 cas12a 基因插入片段与N端His标签融合;表达受lacI控制的T7启动子控制] *注：Acidaminococcus sp。也可以使用该表达将表达载体6His-MBP-TEV-huAsCpf1（Addgene，目录号：90095）和6His-MBP-TEV-huLbCpf1（Addgene，Invitrogen）的BV3L6 Cas12a（AsCas12a）和滑丝螺杆菌细菌ND2006 Cas12a（LbCas12a）目录号：90096）
13. 胰蛋白胨（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：LP0042B）
14. 酵母提取物（BD，Bacto TM，目录号：212720）
15. 氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：S271-10）
16. 氢氧化钠（NaOH）（Merck，EMD Millipore，目录号：106462）
17. 乙醇（Fisher Scientific，目录号：BP2818500）
18. 氯霉素（Fisher Scientific，目录号：BP904100）
19. 卡那霉素硫酸盐（Thermo Fisher Scientific，目录号：11815024）
20. 甘油（Fisher Scientific，目录号：BP229-4）
21. IPTG（Fisher Scientific，产品目录号：BP1755-1）
22. 琼脂（Acros Organics，目录号：400400050）
23. LB培养基（见食谱）
24. 1,000x氯霉素溶液（34 mg / ml）（见食谱）
25. 1,000x卡那霉素溶液（50mg / ml）（见食谱）
26. 1M IPTG（异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷）（见食谱）
27. 甘油库存（50％溶液）（见食谱）＆nbsp;
FnCas12a的纯化
1. 5毫升HisTrap HP（GE Healthcare，目录号：17524701）
2. 透析管，高保留无缝纤维素管，平均平宽23毫米（0.9英寸），截留分子量12,400，保留率99.99％（Sigma-Aldrich，目录号：D0405）
3. 透析管夹（Sigma-Aldrich，目录号：Z371092）
4. 5毫升HiTrap肝素HP（GE Healthcare，目录号：17040601）
5. 具有Ultracel-100膜的Amicon Ultra-15离心过滤装置（Merck，EMD Millipore，目录号：UFC9100）
6. HiLoad 16/600 Superdex 200 pg（GE Healthcare，产品目录号：28989335）
7. Gosselin TM Round-Base 10-ml试管（Corning，Gosselin TM，目录号：TP10-01）或其他相当的级分收集管
8. Nalgene TM Oak Ridge高速离心管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：3114-0050）或相当的50-ml离心管
9. 膜过滤器，混合纤维素酯（Merck，MF-Millipore，目录号：HAWP04700）
10. 膜过滤器，混合纤维素酯（Merck，MF-Millipore，目录号：GSWP04700）
11. 来自过夜培养的细胞沉淀，其中FnCas12a表达（来自程序A）
12. 无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，Roche Diagnostics，目录号：11873580001）
13. 来自鸡蛋白的溶菌酶（Sigma-Aldrich，目录号：L6876-5G）
14. β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
15. TEV蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：T4455）
16. 12％Mini-PROTEAN TM TGX TM预制蛋白凝胶（Bio-Rad Laboratories，目录号：4561043）
17. 用于SDS-PAGE的4×Laemmli蛋白样品缓冲液（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610747）
18. Bio-Safe TM Coomassie Stain（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610786）
19. PageRuler预染蛋白梯度，10至250 kDa（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：26619）
20. 二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
21. 乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）
22. 氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：S271-10）
23. Tris（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：17926）
24. 咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：I0250）
25. 盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：258148）
26. 氯化钾（KCl）（Merck，EMD Millipore，目录号：104933）
27. HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
28. 氢氧化钾（KOH）（Sigma-Aldrich，目录号：757551）
29. 甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G8898）
30. 十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
31. 1 M DTT（二硫苏糖醇）库存（见食谱）
32. 0.5M EDTA（乙二胺四乙酸二钠）储备液（pH8）（见食谱）
33. 裂解缓冲液（见食谱）
34. 洗涤缓冲液（见食谱）
35. 洗脱缓冲液（见食谱）
36. 透析缓冲液（见食谱）
37. 稀释缓冲液（见食谱）
38. IEX-A缓冲液（见食谱）
39. IEX-B缓冲液（见食谱）
40. SEC缓冲液（见食谱）
41. 10x SDS-PAGE电泳运行缓冲液（见食谱）
使用纯化的Cas12a进行活性测定
1. 纯化的Cas12a核酸酶（来自程序B）
2. 无核酸酶的水
3. 蛋白酶K，分子生物学级（新英格兰生物实验室，目录号：P8107S）
4. 含有与靶DNA互补的靶向序列的crRNA
  注意：RNA可以作为脱盐RNA寡核苷酸订购，或者作为来自RNA合成公司如Sigma-Aldrich或IDT的PAGE纯化的RNA寡核苷酸订购。
5. 含有靶序列和5'TTTN PAM序列的DNA底物
  注：底物DNA可以是环状或线性化的质粒，PCR产物或合成的寡核苷酸）。举例来说，活性测定中使用的DNA底物和crRNA如图2所示。
  
  图2. Cas12a crRNA-DNA靶向复合物的示意图预期的切割位点用红色箭头表示。
6. GeneRuler 1 kb DNA Ladder（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：SM0311）或同等产品
7. DNA凝胶负载染料[例如，6x DNA加载染料（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：R0611）]
8. InvitrogenTM SYBR TM Safe DNA凝胶染色（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：S33102）
9. 氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：S271-10）
10. 氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）
11. HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
12. 乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）
13. 盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：258148）
14. 10x核酸酶反应缓冲液（见食谱）

设备

注意：可以使用等效设备。

FnCas12a在E中的表达大肠杆菌Rosetta TM 2
1. 移液器（Corning，型号：Lambda TM Plus单通道移液器，目录号：4070; 4074; 4075）
2. 新不伦瑞克TM Innova 42培养箱（Eppendorf，New Brunswick TM，型号：Innova 42，目录号：M1335-0002）或可以设置在37°C的等效培养箱。
3. Sorvall LYNX 4000超速离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Sorvall LYNX 4000，目录号：75006580）或可以冷却至4°C的等同离心机并且可以执行高达6,000 xg
4. 新不伦瑞克TM Innova 44 / 44R（Eppendorf，New Brunswick TM，型号：Innova 44 / 44R ，产品目录号：M1282-0002）或任何同等的振荡培养箱，温度可以设定在37°C和18°C。
5. 细胞密度计（GE Healthcare，型号：Ultrospec TM 10，目录号：80-2116-30）或可以测量600nm悬浮液中细胞密度的等效分光光度计。
6. 冰水浴（水和冰混合）
FnCas12a的纯化
1. 带有VS 70 T Sonotrode（Bandelin）或同等超声波均质器/超声波仪或法国压力室（French Press）的SONOPULS HD（Bandelin electronic，型号：HD 3200）用于细胞裂解
2. 带有5 ml HisTrap HP（GE Healthcare，型号：蠕动泵P-1，产品目录号：18111091）的连接器的蠕动泵P-1或同等蠕动泵
3. 用于蠕动泵P-1（GE Healthcare，目录号：11300082）的管道连接器
4. ÄKTApurifier10 FPLC系统（GE Healthcare，型号：ÄKTApurifier10，产品目录号：28406264）或同等FPLC系统
5. Sorvall LYNX 4000超速离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Sorvall LYNX 4000，目录号：75006580）或可以冷却至4°C的等同离心机并且可以执行高达30,000 x g
6. pH计（QiS，型号：B210）
7. 用于过滤的过滤器支架组件（Merck，产品目录号：XX1014700或Nalgene，Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：DS0320-2545）或等效的过滤器支架组件。
8. 膜片式真空泵LABOPORT N 820（ABM van Zijl B.V，目录号：ABMK N8203FT18）或等效真空泵
9. Nanodrop（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：NanoDrop TM 2000，目录号：ND-2000）
10. Mini-PROTEAN Tetra细胞（Bio-Rad Laboratories，型号：Mini-PROTEAN Tetra Cell，目录号：1658004EDU）或等效的垂直电泳系统。
11. 爱普生Perfection V850 Pro扫描仪（Epson，型号：Perfection V850 Pro）或适用于SDS-PAGE凝胶成像的等价扫描仪或成像仪。
使用纯化的Cas12a进行活性测定
1. Eppendorf TM 5424微量离心机（Eppendorf，型号：5424，目录号：022620498）
2. MUPID One水平电泳系统（Bulldog Bio，产品目录号：MU2）或等效的水平电泳系统
3. G：BOX F3（Syngene，型号：G：BOX F3，目录号：05-GBOX-F3）gel doc系统或相当的DNA琼脂糖凝胶成像设备

程序

E的转换。用含有pDS015质粒的大肠杆菌Rosetta TM 2（DE3）和制备甘油贮存液
1. 将1ng pDS015质粒DNA直接加入到50μl化学感受态E中。大肠杆菌Rosetta TM 2（DE3）细胞。
2. 轻轻搅拌以混合并将管置于冰上5分钟。
3. 在42°C水浴中将管子加热30秒;不要动摇。
4. 立即将试管置于冰上2分钟。
5. 将250μl室温无菌SOC培养基（由制造商提供）加入管中。
  在37℃下孵育，同时以250rpm振荡60分钟。
6. 将5-50μl转化混合物分别涂布在含有34μg/ ml和50μg/ ml氯霉素和卡那霉素的LB琼脂平板上。如果电镀少于25μl的转化，我们建议在电镀前向转化混合物中加入50μl无菌SOC培养基以促进LB琼脂平板表面上的菌落分布。
7. 在37℃孵育LB琼脂平板过夜。
8. 第二天，使用无菌枪头从转化平板上挑选单个菌落并接种10ml LB在50ml管中。
9. 在37℃振荡培养箱中以160rpm振荡孵育50ml试管过夜。
10. 第二天，在500毫升50％无菌甘油中加入500微升过夜培养液，置于2毫升螺旋管或冷冻管中，轻轻混合。
11. 将甘油储存在-80°C以备将来使用。
E中大量表达FnCas12a。大肠杆菌Rosetta TM 2（DE3）
第1天。培养基，缓冲液和单菌落的制备
1. 准备20毫升的LB在100毫升锥形瓶（用于开始过夜培养）（配方A1）。
2. 准备三个5-L锥形瓶，每个包含1.5L的LB培养基（用于大规模繁殖和蛋白质纯化）（配方A1）。
3. 准备抗生素和储备溶液（配方A2和A3）。
4. 准备净化所需的缓冲液（配方B1-B8）。
5. 排出甘油库存的E。在含有50μg/ ml卡那霉素和34μg/ ml氯霉素的LB琼脂平板上用pDS015转化的大肠杆菌Rosetta TM 2（DE3）。
6. 在37℃培养箱中培养LB琼脂平板过夜。
第2天。隔夜文化准备
1. 将20μl50mg / ml卡那霉素储备溶液和20μl34mg / ml氯霉素储备溶液加入到来自第1天的100ml锥形瓶中的20ml高压灭菌的LB培养基中。
2. 使用无菌吸头，选择一个单一的E菌落。用来自第1天的LB琼脂平板的pDS015转化的大肠杆菌Rosetta TM 2（DE3）。
3. 使用菌落接种含有卡那霉素和氯霉素的培养基。
4. 使用棉塞松散地关闭100毫升的锥形瓶
5. 在振荡培养箱（设定为160rpm）中37℃孵育细菌培养物16-20小时。
第3天3.过度表达FnCas12a的细胞大规模扩增
1. 取三个高压灭菌的5升锥形瓶*，每个瓶含有来自第1天的1.5L LB培养基。
2. 向每个烧瓶中加入1.5毫升50毫克/毫升的氯霉素溶液。
3. 向每个烧瓶中加入1.5ml 34mg / ml卡那霉素溶液。
4. 向每个烧瓶中加入15ml在第2天制备的过夜培养物。
5. 在摇床中以160转/分的速度在37°C孵育培养瓶
6. 每半小时监测培养物的OD 600nm。一旦达到0.5-0.6的OD 600nm（通常需要约3-4小时），将含有培养物的锥形瓶转移到冰水浴中并孵育（冷冲击）以用于15分钟。这一步减缓了E的代谢。并触发表达可能有助于FnCas12a在表达过程中折叠的冷休克蛋白。
7. 向每个培养瓶中加入200μl过滤灭菌的1M IPTG溶液至培养物以诱导FnCas12a的表达。
8. 将培养物转移到18℃摇动培养箱（设定为120rpm）过夜表达（约16小时）。
  注意：
  1. *也可以表达较小体积的细胞培养物（例如，在2-L锥形瓶中的单个1.5L培养物或一个或多个750ml培养物）
  2. **当使用带挡板的锥形瓶时，将振荡培养箱的速度降低至120rpm以防止形成泡沫。＆nbsp;
第四天 - 第一部分。过度表达FnCas12a的细胞的大规模增殖（续）
1. 将第3天的过夜培养物转移到离心瓶中。
2. 通过在4℃以6,000×gg离心培养物15分钟来收获细胞。
3. 弃去上清液并将沉淀的细胞储存在-20°C（一周内用于最佳纯化）或-80°C（用于长期储存）或直接进行纯化。预期产量为每升细胞培养物约5克细胞沉淀。
第4天 - 第二部分。纯化FnCas12a-I部分
1. 如果继续使用冷冻细胞沉淀物，将细胞沉淀物从冰上第4天 - 第I部分解冻30-60分钟。如果在蛋白质表达后直接进行，请跳过此步骤。
  注意：所有后续步骤应在冰上或4°C下进行。
2. 在裂解缓冲液（每克细胞沉淀约2.5-5ml裂解缓冲液）中重悬全部细胞沉淀。
3. 每50 ml添加1片cOmplete TM蛋白酶抑制剂。
4. 加入溶菌酶至最终浓度为1mg / ml。
5. 在冰上孵育30分钟。
6. 如果使用French Press进行细胞裂解：在溶菌酶处理后，将细胞悬浮液通过French Press在16,000 psi下两次。
7. 如果使用超声处理进行细胞裂解：在溶菌酶处理后，通过使用具有适当尖端的超声波仪和适用于裂解大体积细胞悬液的方案来裂解细胞悬液。对于我们的设置（Bandelin SONOPULS HD with VS 70 T tip），我们使用以下设置：10分钟总时间，1秒开，0.7秒关和20％振幅。如图3所示，细胞悬液在裂解后通常具有淡褐色。
  注意：使用法国压力室或超声波仪可获得大致相同的产量-FnCas12a非常稳定，在超声处理过程中很少或不会有蛋白质丢失。但请记住，超声处理通常不适合大量使用，因此应适用于大量细胞悬液裂解的协议。
  
  图3.裂解后，细胞悬液呈棕褐色，粘稠性较低
8. 将溶胞产物倒入（a）离心管中，并在30000gxg离心45分钟，4℃。
9. 将上清液转移到（a）干净的50ml管中。这是'无细胞提取物'。
  注：可将样品溶解的细胞沉淀物储存在4°C下，通过SDS-PAGE分析后分析FnCas12a的存在以评估其溶解度并确定细胞溶解是否成功。 br />
10. 将无细胞提取液通过0.22μm膜过滤器，并将滤液保存在无菌管中。
11. 使用蠕动泵，使用3-5个柱体积的蒸馏水清洗HisTrap HP色谱柱，以除去储存树脂的溶液。
12. 使用蠕动泵，用至少5个柱体积的裂解缓冲液平衡HisTrap HP，流速为2 ml / min。
13. 使用蠕动泵*，将过滤后的无细胞提取物以1 ml / min的流速通过HisTrap HP色谱柱，并在（a）标记为“流过”的50 ml管中收集流通液* *。
  注意：
  1. *对于样品加载，可以使用超级循环代替蠕动泵。
  2. **流通样品可以保存在4°C，后来通过SDS-PAGE分析分析FnCas12a的存在以确定蛋白质是否与柱结合（如果蛋白质的大部分留在流通中，再生或更换柱子）。在某些情况下，高量的蛋白质可能会使色谱柱饱和。为了回收流通过程中的蛋白质，可以将流通（重新）加载到另一个或再生的HisTrap HP色谱柱上。＆nbsp;
  下一步色谱步骤使用ÄKTAFPLC系统进行。
14. 用Wash Buffer平衡ÄKTAFPLC系统，直至280 nm处的吸光度达到稳定基线。将HisTrap HP色谱柱转移到ÄKTAFPLC上，使用洗涤缓冲液以2 ml / min的流速洗脱色谱柱10-15倍，或直到280 nm处的吸光度用洗涤缓冲液接近**稳定。
  收集第一批3-4个10-ml洗涤级分*，放入单独的标记为“穿透＃”的试管中。
  备注：
  1. 可以保存并在稍后使用SDS-PAGE分析检查FnCas12a的存在以确定它在洗涤过程中是否从柱上洗脱出来。
  2. 即使在低浓度下，洗涤缓冲液中的咪唑也可以除去少量感兴趣的蛋白质。因此，开始洗脱蛋白质时，280 nm处的吸光度接近稳定，以避免不必要的目标蛋白质损失。＆nbsp;
15. 使用洗脱缓冲液以2 ml / min的流速洗脱蛋白质，同时分馏至1 ml样品，收集洗脱液并将洗脱液保存在标有“洗脱级分＃”的单独试管中。图4显示了通过Histrap HP（5ml）亲和纯化纯化的FnCas12a的典型洗脱色谱图的实例。＆nbsp;
  
  图4.通过Histrap HP（5ml）亲和纯化纯化的FnCas12a的代表性洗脱色谱图将75ml无细胞提取物加载到柱上。洗脱级分为1ml，流速设定为2ml / min。 280nm处的吸光度以Δ280（蓝色）和Δ254（红色）的毫体吸光度单位表示。请注意，在niNTA纯化后，A254不具有很多信息，因为在这个阶段，样品被各种核酸污染。绿线表示洗脱缓冲液的浓度（在色谱图开始时为0％，在色谱图的最后阶段为100％）。
16. 用4x Laemmli蛋白样品缓冲液稀释10μl收集的级分，95°C加热5 min，然后在SDS-PAGE凝胶上分离样品以评估样品的纯度。
17. 将存在蛋白质的洗脱组分合并，并检查280nm处的吸光度以估计蛋白质浓度。 FnCas12a的消光系数为145,820 M -1 -1 cm -1。此步骤的典型产量为〜25 mg /升表达培养**。
18. 在使用前向2L透析缓冲液中加入2ml（最终1mM）1M DTT原液和4ml 0.5M EDTA原液。使用透析缓冲液将混合的蛋白质组分的体积增加至25ml。每100毫克蛋白添加1毫克TEV。
19. 以MWCO为12,400的透析膜并将其浸入透析缓冲液中1分钟。使用夹子将透析膜的一端封闭，制成袋子。
20. 将组合的蛋白质样品吸入透析膜袋并用另一个夹钳关闭另一端。在4℃缓慢搅拌下透析2小时的透析缓冲液。
  注意：
  **由于蛋白质和核酸污染，此时产量很可能被高估。＆nbsp;
第5天。FnCas12a-Part II的纯化
1. 将来自透析膜的蛋白质样品转移至50ml管中，并在4℃下以4,500×gg离心10分钟以除去潜在的沉淀蛋白质。
2. 使用样本稀释缓冲液* 1：1稀释样本
3. 使用蠕动泵，用3-5个柱体积的蒸馏水清洗色谱柱，以去除色谱柱树脂储存的溶液。
4. 使用蠕动泵，用至少5个柱体积的IEX-A缓冲液平衡肝素FF柱，流速为2 ml / min。
5. 使用蠕动泵将蛋白质样品加载到肝素FF柱上。
6. 用IEX-A缓冲液平衡ÄKTAFPLC，直到280 nm处的吸光度达到稳定基线。
7. 将肝素FF柱转移至ÄKTAFPLC，并用2 ml / min的10 ml IEX-A缓冲液清洗。用适当标记的清洁管收集流通物。
8. 用流速为2 ml / min的0至50％IEX-B缓冲液以60 ml的线性梯度洗脱蛋白质，将洗脱液以1 ml流分收集在适当标记的干净管中。图5显示了通过肝素FF（5ml）亲和纯化纯化的FnCas12a的典型洗脱色谱图的实例。＆nbsp;
  
  图5.通过肝素FF（5ml）亲和纯化纯化的FnCas12a的代表性洗脱色谱图。加载50ml样品。流速设定为2ml / min，洗脱级分为1ml。 A 280（蓝色）和A 254（红色）的吸光度用毫安吸光度单位表示。绿线表示IEX-B的浓度（在色谱开始时为0％，浓度在60毫升时上升到50％，在色谱图的最后阶段，浓度上升到100％以清洗色谱柱） >
9. 用4x Laemmli蛋白样品缓冲液稀释10μl收集的级分，95°C加热5 min，然后在SDS-PAGE凝胶上分析以评估样品的纯度。考马斯亮蓝染色的10％SDS-PAGE凝胶的实例如图6所示.FnCas12a肝素FF洗脱级分在其上被分辨。
  
  图6.代表性的考马斯亮蓝染色12％SDS-PAGE凝胶，FnCas12a肝素FF洗脱组分被分辨。M：PageRuler TM Plus Prestained Protein Ladder。标记带的大小以kDa表示。 IN：过夜透析后浓缩的TEV蛋白酶处理的Histrap HP洗脱级分的输入样品。 FT：从柱子流出。除了由FnCas12a形成的大带外，还可以观察到其他（污染）带。 A9-C1：蛋白质吸收峰附近的洗脱级分。 FnCas12a蛋白表现为尺寸略大于130kDa的条带。在这种情况下，馏分B14-C1被合并。
10. 将含有纯蛋白质（尽可能少的污染物）的洗脱级分组合并通过将样品转移至具有100kD膜MWCO的Amicon Ultra-15离心过滤器单元并将样品在4,500xg /在4℃下，直至最终体积为＆lt;达到1毫升。
11. 将样品转移至Eppendorf管中，并在预冷的（4℃）微量离心机中以最大速度离心样品2分钟以去除潜在的沉淀。
12. 在ÄKTAFPLC上分别用10 ml和240 ml SEC缓冲液平衡2 ml注射环和HiLoad 16/600 Superdex 200 pg柱。
13. 使用2ml注射环将蛋白浓缩物加载到HiLoad 16/600 Superdex 200 pg柱上，并使用SEC缓冲液以1ml / min的流速将样品溶解在柱上。
14. 收集1毫升的馏分。 HiLoad 16/600 Superdex 200 pg柱尺寸排阻纯化纯化的FnCas12a的典型洗脱色谱图示例如图7所示。
  
  图7.在HiLoad 16/600 Superdex 200 pg柱上解析的FnCas12a的代表性洗脱色谱图。加载1ml样品。洗脱级分为1ml，流速设定为1ml /分钟。 A 280（蓝色）和A 254（红色）的吸光度用毫安吸光度单位表示。
15. 用4x Laemmli蛋白样品缓冲液稀释10μl收集的级分，在95°C加热5 min，然后在10％SDS-PAGE凝胶上分离，以评估样品的纯度。考马斯亮蓝染色的10％SDS-PAGE凝胶的实例显示在图8中.FnCas12a SEC洗脱级分在其上被分辨。
  
  图8.代表考马斯亮蓝染色的12％SDS-PAGE凝胶，其上分辨FnCas12a SEC洗脱级分。M：PageRuler Plus预染蛋白梯级。标记带的大小以kDa表示。 IN：浓缩的输入样本。除了由FnCas12a形成的大带外，还可以观察到其他（污染）带。 C1-C12：靠近蛋白质吸收峰的洗脱部分。 FnCas12a蛋白表现为尺寸略大于130kDa的条带。在这种情况下，馏分C3-C9被合并。
16. 合并和浓缩含有纯蛋白质且不含（或可忽略量）污染物的馏分。
17. 有关纯度和最终蛋白质产量的分析，请参阅数据分析部分。此步骤中典型的蛋白质产量为每升E-E约5-10mg FnCas12a。大肠杆菌表达培养。 AsCas12a或LbCas12a的表达和纯化通常会导致Cas12a产量稍高。
18. 将样品稀释至适合后续实验的浓度（例如，10μM）**并将蛋白质等分至所需浓度并储存于-80℃。
  注意：
  1. *对于LbCas12a，由于在较低盐浓度下LbCas12a的不稳定性，以2：1比例（蛋白质样品：稀释缓冲液）稀释。
  2. **建议将蛋白质储存在≥10μM，并在使用前将其稀释到合适的浓度。在较低浓度时，由于冷冻/解冻和用于储存的管/容器表面的非特异性吸附，蛋白质的相对高比例可能会丢失。
第6天：用于确认纯化的FnCas12a活性的体外切割试验
注意：
1. 我们强烈建议戴上手套并使用无核酸酶的试管和试剂以避免RNase污染。
2. 反应体积通常为20μl，但可根据需要放大。反应应在无核酸酶1.5 ml Eppendorf管或200μlPCR（带）管中组装。
3. 通过在冰上用无核酸酶的水稀释原液制备1μMcrRNA溶液。
4. 通过在冰上用无核酸酶的水稀释原液制备0.1μM底物质粒或线性DNA溶液。
1. 在室温下制备以下两步反应（摩尔比Cas12a：crRNA：底物= 10：20：1）：
2. 充分混合并在微型离心机中进行脉冲旋转。
3. 37°C孵育30分钟。
4. 加1μl蛋白酶K，充分混合并在微型离心机中脉冲旋转。
5. 在室温下孵育10分钟。
6. 加入4μl6x DNA上样染料。
7. 将样品溶解在1％琼脂糖凝胶上，用SYBR TM安全DNA凝胶染色剂预先染色。
8. 使用配备有紫外线范围或470-530纳米之间的激发源的成像系统使凝胶可视化。图9中显示了使用FnCas12a：crRNA和线性DNA底物的体外剪切测定的实例。
图9. 2,774bp线性靶DNA底物被FnCas12：crRNA复合物切割，产生1,209bp和1,565bp的产物。M：GeneRuler 1kb DNA Ladder。

数据分析

注意：本节解释了如何在纯化方案的最后一步（即尺寸排阻色谱法）之后确定蛋白质的产量和纯度。

使用NanoDrop分光光度计测量蛋白质浓度。当使用NanoDrop软件方法'蛋白A 280'时，测量260nm处的吸收和280nm处的吸收。
纯化的蛋白质样品的260/280比例可用于确定复合物是否不含核酸。通常，纯蛋白质样品具有〜0.57的260/280比率。我们通常在0.54和0.61之间达到260/280的比率。核酸污染迅速将260/280比率提高到1以上。
使用280nm处测得的吸光度来确定最终的蛋白质浓度。
1. 当使用NanoDrop软件的'其他蛋白质（ε+ MW）'选项时，提供FnCas12a的摩尔消光系数（144,330 M -1 -1cm -1 -1）和它的分子量（151kDa）。对于AsCas12a，这些值分别为15,780 M -1 -1 cm -1和156 kDa。对于LbCas12a，这些值为181,690 M -1 -1cm -1和149 kDa。
2. 当使用NanoDrop软件的'1 Abs = 1 mg / ml'选项时，使用校正因子来确定真正的蛋白质浓度。 FnCas12a，AsCas12a和LbCas12a的校正因子分别为0.951,1.009和1.221。例如，如果NanoDrop测量结果的蛋白质浓度为5.0 mg / ml FnCas12a（假设1 Abs = 1 mg / ml），则您的实际蛋白质浓度为5 / 0.951 = 5.26 mg / ml。为了计算以mM为单位的蛋白质浓度，使用以下公式：蛋白质浓度（以mg / ml计）/分子量（以kDa计;如上所述）。例如，如果您有含有5.26 mg / ml蛋白质的FnCas12a样品，则蛋白质浓度为5.26 / 151 = 0.035 mM = 35μM。

食谱

媒体，抗生素和储备溶液
1. LB培养基（1L）
  1. 称出10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克NaCl。
  2. 使用半水补充至800毫升
  3. 用NaOH调节pH至7.5
  4. 使用半水加注至1升
  5. 在121°C高压灭菌30分钟
  6. 在室温下储存
2. 1,000x氯霉素原液（34mg / ml原液）
  1. 称出0.34克氯霉素，并将其溶解于10毫升100％乙醇中。
  2. 穿过0.22μm注射器过滤器
  3. 在-20°C储存
3. 1,000x卡那霉素原液（50mg / ml原液）
  1. 称取0.5 g硫酸卡那霉素，并将其溶解于10 ml无菌水中。
  2. 穿过0.22μm注射器过滤器
  3. 在-20°C储存
4. 甘油储备（50％溶液）
  1. 将50毫升100％甘油溶液加入250毫升瓶中。当移液甘油时，使用乙醇无菌剪刀切断移液器的末端以使移液更容易
  2. 添加50毫升半水
  3. 在121°C高压灭菌30分钟
  4. 在室温下储存
5. 1M IPTG（异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷）
  1. 称出2.38克IPTG并溶解于10毫升无菌水中
  2. 穿过0.22μm注射器过滤器
  3. 在-20°C储存
6. 1 M DTT（二硫苏糖醇）库存
  1. 称取1.5克DTT，并将其溶解于10毫升无菌水中。
  2. 穿过0.22μm注射器过滤器
  3. 在-20°C黑暗处储存
7. 0.5M EDTA（乙二胺四乙酸二钠）储备液（pH8.0）
  1. 称取18.16g Na 2 EDTA·2H 2 O并溶于80ml去离子水中。
  2. 用氢氧化钠颗粒调整至pH8.0（需要约2克NaOH）
  3. 使用半水补足至100毫升
  4. 通过高压灭菌高压灭菌器在121°C灭菌30分钟
  5. 在室温下储存
    *注：EDTA的二钠盐不会进入溶液，直到通过加入NaOH将溶液的pH调节至约8.0。
缓冲区
1. 裂解缓冲液（1 L）
  1. 称出29.22g NaCl（最终500mM），2.42g Tris（最终20mM）和0.68g咪唑（最终10mM）并溶解于900ml去离子水中。
  2. 使用HCl将pH值调节至8.0
  3. 使用半水加注至1升
  4. 过滤器使用0.22微米膜过滤器
  5. 在4°C储存
2. 清洗缓冲液（1 L）
  1. 称出29.22g NaCl（最终500mM），2.42g Tris（最终20mM）和1.36g咪唑（最终20mM），并溶解于900ml去离子水中。
  2. 使用HCl将pH值调节至8.0
  3. 使用半水加注至1升
  4. 过滤器使用0.22微米膜过滤器
  5. 在4°C储存
3. 洗脱缓冲液（1L）
  1. 称出29.22g NaCl（最终500mM），2.42g Tris（最终20mM）和17g咪唑（最终250mM）并溶解于900ml去离子水中。
  2. 使用HCl将pH值调节至8.0
  3. 使用半水加注至1升
  4. 过滤器使用0.22微米膜过滤器
  5. 在4°C储存
4. 透析缓冲液（2 L）
  1. 称取37.27克KCl（最终250毫摩尔）和4.77克HEPES（最终20毫摩尔）并溶解于1,900毫升去离子水中。
  2. 使用KOH调节pH值至8.0
  3. 使用半水加注至2升
  4. 过滤器使用0.22微米膜过滤器
  5. 在4°C储存
5. 稀释缓冲液（200ml）
  1. 称取0.24 g HEPES（最终10 mM）并溶于100 ml去离子水中
  2. 使用KOH调节pH值至8.0
  3. 使用半水补足200毫升
  4. 过滤器使用0.22微米膜过滤器
  5. 在4°C储存
6. IEX-A缓冲液（1L）
  1. 称出11.18克KCl（最终150毫摩尔）和4.77克HEPES（最后20毫摩尔）并溶解在900毫升去离子水中。
  2. 使用KOH调节pH值至8.0
  3. 使用半水加注至1升
  4. 过滤器使用0.22微米膜过滤器
  5. 在4°C储存
7. IEX-B缓冲液（1 L）
  1. 称取149.10g KCl（最终2M）和4.77g HEPES（最终20mM）并溶于900ml去离子水中。
  2. 使用KOH调节pH值至8.0
  3. 使用半水加注至1升
  4. 过滤器使用0.22微米膜过滤器
  5. 在4°C储存
8. SEC缓冲液（1 L）
  1. 称出37.27g KCl（最终500mM），4.77g HEPES（最终20mM）并溶解于900ml去离子水中。
    使用前添加1 ml（最终1 mM）1 M DTT原液
  2. 使用KOH调节pH值至8.0
  3. 使用半水加注至1升
  4. 过滤器使用0.22微米膜过滤器
  5. 在4°C储存
    注意：将pH值取决于温度时，将缓冲液的pH值设置为不同的温度会影响最终的pH值。然而，根据我们的经验，缓冲液的pH值可以设定在4°C或RT下，而不会对纯化过程产生重大影响。
9. 10x SDS-PAGE电泳运行缓冲液（1L）
  1. 称取30.0g Tris（终浓度250mM），144g甘氨酸（终浓度为1920mM），10g SDS [终浓度1％（w / v）]，并溶解于900ml去离子水中。
  2. 使用半水加注至1升
10. 10x Cas9核酸酶反应缓冲液（10ml）
  1. 称取0.58g NaCl（最终1M），0.1g MgCl 2·6H 2 O（最终50mM），0.476HEPES（最终200mM）和3.72mg EDTA （最终1mM）并溶解在8ml无核酸酶的水中。
  2. 使用HCl将pH调节至6.5并用无核酸酶的水填充至10ml

致谢

该协议改编自Swarts等人（2017;参考文献26）。这项工作得到荷兰科学研究组织（NWO）对JvdO（NWO-TOP，714.015.001。）的资助，由瑞士国家科学基金会（SNSF）项目资助给MJ（SNSF 31003A_149393）由欧洲分子生物学组织（EMBO）向DCS提供奖学金（EMBO ALTF 179-2015和EMBO aALTF 509-2017）。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

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