材料和试剂

GeneMate单独0.2ml PCR管（BioExpress，目录号：T-3035-1）
带BD Ultra-Fine 6 mm x 31G针头的BD Veo胰岛素注射器（BD，目录号：324910）
Corning TM 96孔透明底部黑色聚苯乙烯微孔板（Corning，目录号：3904）
VWR 组织培养48孔板（VWR，目录号：10861-560）
BALB / c小鼠，通常是6周龄雌性小鼠
ElectroMAX TM DH10B TM细胞（Thermo Fisher Scientific，目录号：18290015）
贴壁HEK 293细胞和Huh7细胞
MAX效率TM DH10B TM细胞（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，产品目录号：18297010）
JBS DNA-Shuffling Kit（Jena Bioscience，目录号：PP-103）
DNase I，不含RNA酶（1U /μl）（Thermo Fisher Scientific，目录号：EN0521）
EDTA
QIAquick PCR纯化试剂盒（250）（QIAGEN，目录号：28106）
纯化的单链AAV（任何血清型）（Xiao等人，1998）
PfuUltra高保真DNA聚合酶（Agilent Technologies，Santa Clara，CA）
野生型AAV2质粒psub201，质粒pXR2（RepCap质粒）和pXX6-80（辅助质粒含有来自腺病毒的基因E4，E2a和VA）
1x PBS（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：14190144）
来自Duchenne肌营养不良症临床研究的患者血清（Bowles et ，2012）
腺病毒dl309
DNeasy血液和组织试剂盒（QIAGEN，目录号：69504）
SwaI（新英格兰生物实验室，目录号：R0604S）
XbaI（新英格兰生物实验室，目录号：R0145S）
被动裂解缓冲液（Promega，目录号：E1941）
萤光素酶测定底物（Promega，目录号：E151A）
XenoLight D-荧光素 - 生物发光底物（PerkinElmer，目录号：122799）
25毫克/毫升的D-荧光素底物（见食谱）

设备

移液器
Bio-Rad热循环仪（Bio-Rad Laboratories，目录号：1709703）
台式离心机（Eppendorf，型号：5424，目录号：022620401）
VICTOR Multilabel Plate阅读器（PerkinElmer）
小动物麻醉系统（Xenogen，XGI-8气体麻醉系统）
IVIS Lumina体内成像系统（PerkinElmer）

软件

生活图像软件（PerkinElmer）

程序

一个新的AAV混洗库的生成
注：有多种方法可用于生成DNA改组文库，以及制造商提供的一些试剂盒。使用JBS DNA改组试剂盒可以产生DNA改组文库。图1显示了AAV改组库的生成过程。

图1.生成AAV混洗库的流程图
1. 通过PCR分析扩增衣壳基因，使用以相同比例混合的AAV血清型1,2,3，6,8和9作为模板。引物序列显示在Li等人（2008）的表2中。
2. 在37℃下用0.4U DNase I处理总共4μgDNA模板5分钟。加入1μl25mM EDTA终止DNase活化，然后在75℃下加热灭活10分钟。
3. 按照标准程序使用DNA纯化试剂盒纯化大小为100-300bp的DNA片段。
4. 通过Pfu Ultra High-Fidelity DNA聚合酶变性，重新退火并修复纯化的DNA片段，以在0.2ml PCR管中重新组装随机衣壳基因。使用表1中的程序运行PCR分析（Li等人，2008; Yang等人，2009）。
  
  表1. PCR循环参数
5. 将来自DNA改组文库的衣壳克隆到野生型AAV2质粒psub201中以产生AAV衣壳DNA文库（Li等人，2008; Li等人，2016）。
6. 通过共转染两种质粒pXX6-80和AAV衣壳DNA文库，在HEK293细胞中产生AAV改组文库。
7. 用CsCl梯度超速离心纯化单链AAV，并通过定量PCR测定改组AAV的病毒滴度（Xiao等人，1998）。
从小鼠肌肉中分离Nab逃逸的AAV突变体
1. 在50μlPBS和50μl未稀释的患者血清中，在4℃将1×10 10个AAV改组文库病毒颗粒混合2小时。
2. 使用胰岛素注射器通过肌内（i.m.）途径注射AAV /血清混合物到6周龄雌性BALB / c小鼠（注射体积100μl）的后腿肌肉中。
3. 治疗后三天，通过腹膜内注射腺病毒（Adv）dl309的10 7病毒颗粒（vg）。进入相同的肌肉来扩增体内AAV基因组。
  注意：在这一步中可以使用任何可复制的Adv。
4. 在Adv给药后2天从注射的小鼠收集肌肉，并使用DNeasy血液和组织试剂盒提取总DNA。
  注意：有几种方法可用于从组织中分离DNA，还有许多制造商提供的少数几种方法可用于此方法。在这里，我们使用DNeasy血液和组织试剂盒从小鼠肌肉中分离出基因组DNA。在该协议中，从肌肉中分离基因组DNA依赖于柱和旋转步骤。请遵循制造商的协议。
5. 通过使用来自肌肉的基因组DNA作为模板的PCR分析来扩增AAV突变体衣壳。引物序列为F1 5'-CAACTCCATCACTAGGGGTTC和R1 5'-CATGGGAAAGGTGCCAGA，分别定位于AAV2 rep和AAV2 ITR。按照表2中的程序使用PfuUltra高保真DNA聚合酶进行PCR测定。
  
  表2. PCR循环参数
6. 通过QIAquick PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。
7. 用SwaI和XbaI消化并连接到用相同核酸内切酶消化的pXR2中。将构建的质粒转化为DH10b感受态细胞的培养物。
  注：质粒pXR2可以是任何表达AAV包装的AAV Rep基因的表达质粒。
8. 序列克隆并产生AAV / luc突变体载体（Xiao等人，1998）。
AAV突变体在体外的Nab逃避能力
注意：可以通过AAV转导的细胞系可以用于中和测定。当细胞悬浮时加入血清/ AAV混合物。
1. 将种子Huh7细胞以10 5个细胞的密度注入每个孔的48孔板中。
2. 用AAV-Luc（1×10 8 vg）将血清的两倍稀释液（1：4至1：1,024）在37℃孵育1小时。
3. 将混合物（稀释的血清和AAV）加入Huh7细胞并在37℃孵育48小时。
4. 丢弃文化媒体。
5. 用100μl1x的被动裂解缓冲液溶解细胞30分钟。
6. 将20μl裂解的培养基转移到96孔黑板中。
7. 将荧光素酶底物（100μl）加入96孔黑色板中，并短暂地与溶解的培养基混合。
8. 使用光度计读数器（VICTOR Multilabel Plate Reader）测量萤光素酶活性。
9. 将Nab效价定义为萤光素酶活性比无血清对照低50％的最高稀释度。
NAV突变体在小鼠中的逃避能力
1. 用4倍的5倍稀释的患者血清或PBS分离肌肉中分离出的1×10 10 vV的AAV / luc突变体2小时。
2. 注射AAV /血清混合物（总体积100μl）于六周龄雌性BALB / c小鼠的腿内 i.m.
3. 注射后3周时小鼠中的图像荧光素酶表达。使用异氟醚蒸发器麻醉小鼠，并在成像前5分钟腹膜内注射120mg / kg的D-荧光素底物。把鼠标放在IVIS系统的摄像机箱内。
  使用老鼠曝光捕捉开始成像。

数据分析

将AAV改组文库和患者血清的混合物注射到小鼠的肌肉中后，通过IVIS Lumina In Vivo成像系统进行成像，并通过Living Image软件测量光子信号。结果显示在原始论文的图1b中（Li等人，2016年）。
AAV突变体衣壳被回收并测序。结果显示在原始论文的图1a中（Li等人，2016年）。
回收的AAV突变体衣壳用于包装AAV突变体。将AAV突变体和患者血清的混合物施用到小鼠的肌肉中。成像通过IVIS Lumina In Vivo成像系统进行，光子信号由Living Image软件测量。结果显示在原始论文的图2中（Li等人，2016年）。

食谱

25毫克/毫升D-荧光素底物

在DPBS中制备25 mg / ml D-荧光素溶液

致谢

这项工作得到了NIH拨款R01DK084033（对C.L.和R.J.S。），P01HL112761，R01AI072176，R01AR064369和U54AR056953（对R.J.S）的支持。 R.J.S.是Asklepios Biopharmaceutical的创始人和股东。他拥有已获得UNC授权给Asklepios生物制药公司的专利，为此他收到版税。该协议改编自Li等人（2016年）。

参考

Bowles，D.E.，McPhee，S.W.，Li，C.，Gray，S.J.，Samulski，J.J.，Camp，A.S.，Li，J.，Wang，B.，Monahan，P.E。，Rabinowitz，J.E.，Grieger。 JC，Govindasamy，L.，Agbandje-Mckenna，M.，Xiao，X。和Samulski，RJ（2012）
Li，W.，Asokan，A.，Wu，Z.，Van Dyke，T.，DiPrimio，N.，Johnson，JS，Govindaswamy，L.，Agbandje-McKenna，M.，Leichtle，S.，Eugene Redmond， D.，Jr.，McCown，TJ，Petermann，KB，Sharpless，NE和Samulski，RJ（2008）。改组后的AAV基因组的工程和选择：生产靶向生物纳米粒子的新策略。 Mol Ther 16（7）：1252-1260。
Li，C，Wu S，Albright B，Hirsch M，Li W，Tseng YS，Agbandje-Mackenna M，McPhee S，Asokan A，Samulski，R.J.，（2016）。开发患者特异性AAV载体中和用于增强的肌肉基因转移的抗体选择。 Mol Ther 24（1）：53-65。
Xiao，X.，Li，J。和Samulski，R.J。（1998）。在缺乏辅助性腺病毒的情况下生产高滴度的重组腺相关病毒载体。 J Virol 72（3）：2224-2232。
Yang，L.，Jiang，J.，Drouin，LM，Agbandje-McKenna，M.，Chen，C.，Qiao，C.，Pu，D.，Hu，X.，Wang，DZ，Li，J.and肖，X。（2009）。通过DNA改组进行心肌热带腺伴随病毒（AAV） / em> selection。 Proc Natl Acad Sci USA 106（10）：3946-3951。