材料和试剂

蓝细菌
注：蓝藻Synechocystis sp。 PCC 6803在30℃下在BG11培养基（Rippka等，1979）中生长，用20mM TES-KOH（pH8.0）或20mM CHES-KOH（pH9.0）缓冲并在空气中连续鼓泡24小时使用荧光灯照明。
柠檬酸铁铵（Wako Pure Chemical Industries，目录号：092-00802）
Na 2 EDTA·2H 2 O（Wako Pure Chemical Industries，目录号：345-01865）
硝酸钠（NaNO 3）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：192-02555）
磷酸氢二钾（KH 2 HPO 4）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：164-04295）
硫酸镁（MgSO 4）（无水）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：132-00435）
氯化钙（CaCl 2 2）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：038-24985）
碳酸钠（Na 2 CO 3）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：199-01585）
硼酸（H 3 BO 4）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：029-02191）
氯化锰（II）四水合物（MnCl 2·4H 2 O）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：139-00722）
硫酸锌七水合物（ZnSO 4·7H 2 O）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：264-00402）
硫酸铜（II）五水合物（CuSO 4·5H 2 O）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：039-04412）
钼酸钠（VI）二水合物（Na 2 MoO 4·2H 2 O）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：196-02472）
硫酸（Wako Pure Chemical Industries，目录号：192-04696）
硝酸钴（II）六水合物（Co（NO 3）2·6H 2 O）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：031- 03752）
TES（Wako Pure Chemical Industries，目录号：340-02655）
氢氧化钾（KOH）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：168-21815）
3-（3,4-二氯苯基）-1,1-二甲基脲（DCMU）（TCI，目录号：D1328）
注意：3-（3,4-二氯苯基）-1,1-二甲基脲（DCMU）是在光系统II（PSII）中从QA到QB的电子传递抑制剂，因此在光照下氧化PQ池。 DCMU用于确定最大叶绿素荧光水平（Fm）。我们将DCMU溶解在乙醇中（见下文），并将10mM浓度的储备溶液加入样品中（相当于最终浓度为20μM）以确定Fm水平。 DCMU溶液可在-20°C的冷冻箱中储存数月。
乙醇（Wako Pure Chemical Industries，目录号：057-00456）
BG11储备液（见食谱）
BG11中（见食谱）
10mM DCMU乙醇溶液（见食谱）

设备

试管（IWAKI，目录号：TEST30NP）
球形微量子传感器（Heinz Walz，型号：US-SQS / L）
注：光度计和球形微量子传感器用于测量生长光和WATER-PAM光化光的光子通量密度。建议使用球形微型传感器来监测WATER-PAM光化光的光通量密度，因为光线会照射多个方向的样品。
测光表（LI-COR，型号：LI-250A）
荧光计（Heinz Walz，型号：WATER-PAM）
注：WATER-PAM（Heinz Walz， http：// www .walz.com / products / chl_p700 / water-pam / introduction.html ）是一种脉冲幅度调制（PAM）荧光仪，用于测量叶绿素含量低的水生样品。我们使用荧光计的红色LED类型与CUVETTE版本的发射器 - 检测器单元。红色LED类型的WATER-PAM配备了3个峰值为650 nm的LED，用于测量光，12个LED在660 nm处为光化光以及饱和脉冲峰化，3个LED在460 nm处峰值为蓝色光，它优先激发蓝藻中的光系统I（PSI）。
石英比色皿用于WATER-PAM（Heinz Walz，型号：WATER-K）
分光光度计（JASCO，型号：V-650）
注：750nm处的细胞培养物的光密度由分光光度计测定。任何其他常见的分光光度计都可以用于此目的。

软件

PC软件'WinControl'（WALZ，ver.3.22）
注意：WATER-PAM是通过PC软件'WinControl'运行的。

程序

这个协议的目标
为了估计光合作用和呼吸作用的条件，我们确定了代表叶绿素荧光的非光化学猝灭的NPQ，其主要反映了PQ池的氧化还原状态。 NPQ计算为（Fm-Fm'）/ Fm'，其中Fm是在完全氧化的PQ池（即，状态1状态）下确定的最大荧光水平，而Fm'是在PQ降低其中状态2部分被诱导的池条件。
在该协议中，Fm'既在黑暗中（Fm'Dark>）和在低光照下（Fm'LL ）下被确定，并且每个值被用于计算的NPQ在黑暗中（NPQ =（Fm-Fm'Dark Dark> / Fm'Dark ）或者在低光照下NPQ LL =（Fm-Fm'LL ）/ Fm'LL ）。从这两个参数中，我们可以收集有关光合作用和呼吸状况的信息。
蓝藻培养
蓝细菌集胞藻 sp。将PCC 6803在30℃的BG11培养基中在试管中培养（参见“食谱”部分），在空气中连续光照（120μmolm -2 s ^{-1 ）并用于测量。生长光的光子通量密度由具有光度计（LI-250A，LI-COR Biosciences）的球形微型传感器（WALZ，US-SQS / L）确定。}
为测量设置WATER-PAM
在用WATER-PAM测量之前，在＆lt;设置＆gt;设置测量光，光化光和饱和脉冲的电平。 WinControl软件的面板。级别应设置如下：
1. 在12级的2级测量光频率（＆lt; Freq。＆gt;设置）。
2. 在12级的级别2测量光强度（＆lt; Int。＆gt;设置）。
  注意：通过这些设置，测量光线足够弱以避免激发光系统（另请参阅下面的注释）。
3. 饱和脉冲强度（设置）在12级的12级和饱和脉冲宽度0.8秒。
4. 在提供光化光所需的光子通量密度的水平上，在12级的级别10处的光化光幅度（＆lt; Ampl。＆gt;设置）和光化光强度（＆lt; Int。＆gt; > 注：我们通过使用带有光度计的球形微量子传感器（WALZ，US-SQS / L）来确定用MilliQ水填充的比色杯（WALZ，WATER-K）中的光化光通量密度（LI -COR Biosciences，LI-250A）。通过上述设置测量光，饱和脉冲和光化光的光子通量密度为＆lt; 0.01，＆gt; 4,000或100μmol -2 sec -1 ，分别。
通过WATER-PAM记录蓝细菌叶绿素荧光的程序
1. 为测量准备样品
  将细胞培养物调整至在750nm处0.2的光密度，其大致等于集胞藻中1μg/ ml叶绿素。 PCC 6803，当细胞在“材料和试剂”部分描述的条件下生长时。
  备注：
  1. 准备＆gt; 4毫升的样品。 2毫升的样品将用于测量Fm'，另外2毫升的样品用于测量Fm。
  2. Synechocystis sp。 PCC 6803，在约15分钟内测量时不需要搅拌样品。如果您处理需要搅拌的样品，可使用CUVETTE版本的WATER-PAM（WALZ，WATER-S）搅拌装置在测量过程中搅拌细胞培养物。
2. 在暗处（Fm'Dark）或在低光照（Fm'nL）下照射猝灭的荧光水平Fm'的测量值
  1. 在WATER-PAM的样品室中测量之前，将样品（2ml）暗适应10分钟。
    注意：请确保＆lt; Status＆gt;中的复选框WinControl软件的窗口左下方的面板（图1中的黄色方框圈出的软件的屏幕截图）除了＆lt; PM active＆gt;＆gt;在黑暗适应期间复选框。
  2. 在黑暗驯化之后，叶绿素荧光水平的时程变化在＆lt; Chart＆gt; WinControl软件的面板（在图1中用红色方框圈起来）如下：＆nbsp;
    1. 首先，通过点击＆lt; Start Onl开始记录叶绿素荧光。。REC＆GT;按钮位于＆lt; Chart＆gt;右下角（或检查＆lt;图表＆gt;面板右上角的＆lt; Rec。Online＆gt;复选框）。然后，通过检查＆lt; Meas，开始用测量光照明。光＆GT; ＆lt; Status＆gt;中的复选框窗口左下角的面板。叶绿素荧光水平从0上升到Fo'水平（这不是蓝藻细菌的Fo水平，参见下面的注释），最小荧光水平与PQ水池已经在黑暗中降低了。
      注意：请记住，与陆地植物不同的是，由于PQ池的减少，在黑暗驯化的蓝细菌细胞中叶绿素荧光水平已经从原始Fo水平猝灭至Fo'水平呼吸电子在黑暗中运输。
    2. 通过检查＆lt; SAT-Pulse＆gt;来随后施加0.8秒的饱和光脉冲。＆lt; Status＆gt;中的复选框在窗口左下方的面板诱导荧光水平在黑暗中的Fm'水平增加（Fm'Dark ）。这个Fm'在黑暗中的水平值，用于计算NPQ =（Fm-Fm'Dark ）/ Fm'Dark >，显示在＆lt; Result＆gt;面板（在图1中用蓝色方框圈出），并且可以在＆lt; Report＆gt;面板。
      注意：请注意，由于屏幕像素分辨率的问题，由饱和光照引起的荧光增加的峰值高度可能不会达到Fm'的水平（由图1中的'x'表示）。
    3. 随后，通过检查＆lt; Act，开始用光化光照射。光＆GT; ＆lt; Status＆gt;中的复选框面板。在荧光水平达到照明下的稳定水平后，对样品施加饱和脉冲以确定低光照下的Fm'水平（用于计算NPQ 的Fm'水平，其计算如（Fm-Fm'LL ）/ Fm'LL ）。
  图1. PC软件“WinControl”的窗口，显示在<图表>中的叶绿素荧光的时间变化。面板。黑色箭头代表饱和脉冲照明时间。在图1所示的测量中，在黑暗和低光条件下常规测定Fm'后，检查了高光（HL）的影响。
3. Fm的测量，最大荧光水平
  1. 为了测量Fm水平，向步骤D1中制备的2ml新鲜样品中加入20μMDCMU（终浓度）。
    注：由于蓝藻中的叶绿素荧光已在黑暗中猝灭，因此必须在DCMU存在的情况下测定最大荧光水平（Fm），从而氧化PQ池，从而使细胞处于状态1至消除荧光淬灭。在如上所述确定Fm'水平之后，可以将DCMU添加到样品中，但是有时光化照射可能改变样品的条件以干扰Fm的精确测定，尤其是在基因破坏的情况下。因此，建议在单独的新鲜样品中确定Fm水平。
  2. 将样品放置在WATER-PAM的样品室中，然后用测量光开始记录。为了确定Fm水平，在不同光化学水平下对样品施加饱和脉冲。通过点击＆lt; Act右侧的向上箭头，光化光应该从低电平变为高电平。 INT＆GT;值在＆lt; Basic＆gt;通过确认＆lt;结果＆gt;中的Fm'的值，求出荧光信号的最大值。面板。
    注意：在此程序中测量Fm之前，不需要对样品进行暗适应。并且注意Fm的值显示在＆lt; Fm＆gt;＆gt; Box，但不在＆lt; Fm＆gt; ＆lt; Result＆gt;中的框因为＆lt; Fo，Fm＆gt;按钮不使用（请参阅“注释”部分）。 <设置>

数据分析

据报道，在蓝藻中，非光化学淬灭的水平在黑暗条件下和高光照条件下都很高，而在光照强度接近生长光条件下很低，并且非光化学淬灭的光依赖性描述了凹曲线（Campbell和Öquist，1996; Sonoike等人，2001）。黑暗中非光化学淬灭的高水平反映了呼吸链中PQ池的减少，而生长光下的低水平反映了PQ池通过PSI活性的氧化。编码1型NAD（P）H脱氢酶（NDH-1）复合物的亚基的emD ndhF1基因的破坏情况与呼吸链中的PQ库捐献电子的情况不同（Mi 之间的差异减小，光依赖曲线的凹形几乎未观察到（Ogawa和Sonoike，2015）。这表明非光化学猝灭的光依赖性反映了通过PQ池的氧化还原状态在蓝细菌中的呼吸和光合作用之间的平衡。换句话说，非光化学猝灭的水平反映了呼吸和光合作用的条件。
NPQ LL 的值可能受呼吸作用和光合作用的影响。我们已经报道，编码在呼吸电子传递中起作用的NDH-1复合物亚基的 ndhF1 基因或 ndhD1 / D2 基因的破坏导致通过氧化PQ池在光照下由于从呼吸链到PQ池的电子供应不足而引起的NPQ LL 和NPQ 的变化是否由呼吸或光合作用引起，还需要确定NPQ 。
计算NPQ所需的荧光水平值可以在测量过程中或任何时候在面板中的窗口右侧（图1中用蓝色方框圈出）的面板中检查。在<报告>面板中，测量的荧光水平按时间顺序显示。在图1所示的测量中，Fm'Dark或Fm'LL的值分别是481或508，而Fm'的值是用新鲜测量的样本为638.在这种情况下，NPQ 和NPQ 计算为;
NPQ Dark =（Fm-Fm'Dark =）/ Fm'Dark =（638-481）/481=0.332
NPQ LL =（Fm-Fm'LL /）/ Fm'LL =（638-508）/508=0.256
在这种特殊情况下，NPQ （0.362）的值高于NPQ （0.256）。这是通常由来自呼吸链的电子流引起的黑暗中PQ池减少的确切迹象。在 Synechocystis sp的基因破坏者中。呼吸NDH-1复合体电子供给PQ池的PCC 6803缺乏，NPQ Dark小于野生型菌株（Ogawa和Sonoike，2015）。此外，在一些适应低光照环境的蓝藻物种中，据报NPQ Dark的水平也很低（Misumi等人，2016年）。 NPQ从黑暗到NPQ LL的光照下降，可能是由于PQ池在PSI作用下的氧化。因此，NPQ 和NPQ 之间的差异可以用于评估PSI的相对含量。至少在某些情况下，NPQ（即NPQ NPQ ）/ NPQ 的相对差异与NPQ LL）和光系统化学计量比（即em / ie，PSI / PSII的比例）（Ogawa和Sonoike，2015）。有趣的是，这些特征不仅在蓝细菌中观察到，而且在真核藻类中也观察到。据报道，在萤光绿藓Cyanophora paradoxa中，黑暗中的PQ池被氯化吸收减少，并且在黑暗驯化的细胞中表现出高NPQ Dark（Misumi和Misumi Sonoike，2017）。因此，除了在蓝藻中进行测量之外，该方案至少在一些真核藻类中可用于评估光合作用和绿色呼吸之间的相互作用。然而，为了解释结果，我们必须注意以下几点。
必须注意的是，不仅PSII叶绿素发出的荧光，而且来自藻胆体的荧光都不会像PSII荧光那样猝灭，这有助于蓝藻中的荧光信号（Campbell等人，1998年）。藻胆体荧光对荧光信号的贡献导致低估了叶绿素荧光参数，包括NPQ（Ogawa和Sonoike，2016）。因此，在不同藻胆体含量的样品之间不能比较NPQ的值。通过减去藻胆体荧光的贡献来校正荧光信号对于确定叶绿素荧光的实际水平是必要的（Ogawa和Snoike，2016）。
在强蓝光下，橙黄色类胡萝卜素蛋白（OCP）的作用可影响NPQ的值（Kirilovsky，2007）。然而，在这个协议中，OCP的行为是微不足道的，因为红色LED被用作测量光化光。

笔记

通过PAM荧光计测量蓝藻中叶绿素荧光的程序在许多方面与通常用于地面植物的方法不同。 Fm水平可以在陆地植物中通过饱和脉冲在黑暗中进行照明来确定，其中光合作用不活跃并且PQ池被氧化。然而，在很多蓝藻种类中，PQ池在黑暗中被呼吸链减少（Misumi等人，2016）。因此，Fm水平应当在存在DCMU的情况下（坎贝尔等人，1998）或在优先激发PSI的弱蓝光下测定（El Bissati等人， / em>，2000）通过氧化蓝藻中的PQ池。在该协议中，介绍了在DCMU存在下测量Fm的过程。
由于Water-PAM的WinControl软件不是针对蓝细菌开发的，因此该软件在蓝藻测量中有两个问题。首先，通过点击黑暗中的按钮不能确定Fm水平，因为如上所述Fm不能通过蓝藻中的暗适应达到。次要的，由软件自动计算的叶绿素荧光参数的值是没有意义的，因为Fo和Fm水平不能通过>按钮的作用来确定。如果您想使用按钮，则需要在弱蓝光的照明下使用它，这会优先激发PSI并氧化PQ池。

食谱

注意：除非另有说明，溶液均用蒸馏水配制。

BG11库存解决方案
1. 库存解决方案＃1
  0.3克柠檬酸铁铵
  0.05g的Na 2 EDTA·2H 2 O
  每100毫升H 2 O 0
2. 库存解决方案＃2
  30克NaNO 3。
  0.78g的K 2 HPO 4 4 0.73克MgSO 4（无水）
  每1000ml H 2 O
3. 库存解决方案＃3
  1.43克CaCl 2（无水）
  每100毫升H 2 O 0
4. 库存解决方案＃4
  2克的NaNO 3 /
  每100毫升H 2 O 0
5. 库存解决方案＃5
  2.86g的H 3 BO 4 4 1.81g的MnCl 2·4H 2 O·O 0.22g的ZnSO 4·7H 2 O 0.08克CuSO 4·5H 2 O
  0.021g的Na 2 MoO 4·2H 2 O：0 0 10μl硫酸
  0.049克Co（NO 3）2·6H 2 O
  每1000ml H 2 O
6. 库存解决方案＃6
  1 M TES通过1M KOH调节至pH 8.0
除了储备溶液＃1之外，其他BG11储备溶液在121℃高压灭菌20分钟。所有BG11储备溶液都储存在4°C。
BG11培养基
1. 对于1 L BG11培养基，添加
  2毫升储备溶液＃1
  50毫升储备溶液＃2
  2毫升储备溶液＃3
  1毫升储备溶液＃4
  1毫升储备溶液＃5
  20毫升储备溶液＃6
  用H 2 O
  调整最终体积至1,000 ml
2. 将BG11培养基分装到每个30毫升的试管中
3. 将分散的BG11培养基在121°C高压灭菌20分钟，然后在室温下保存
10mM DCMU的乙醇溶液
将DCMU溶解在乙醇中，将溶液储存在-20°C。

致谢

这项工作得到了JSPS创新领域科学研究资助（No. 16H06552和No. 16H06553至K.S.）和Grant-in-Aid for Scientific Research（B）（No. 16H04809至K.S.）的支持。作者宣称没有利益冲突。

参考

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