材料和试剂

总体
1. 适用于2级生物安全（BSL-2）实验室或A-2动物设施（手套，实验室外套，发网，鞋套，安全眼镜）的个人防护。
2. 消毒剂：漂白剂（5000 ppm）或Virkon S.
体外工作
1. 培养瓶（150 cm 2，TPP，目录号：90856）
2. 细胞刮刀（Corning，Falcon ，目录号：353086）
3. Cryotubes（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：377224）
4. 移液吸头（10μl，100μl，1,000μl）
5. 一次性血清移液管（5毫升，10毫升，25毫升）
6. 鼠巨噬细胞（RAW 264.7，ATCC，目录号：TIB-71）
7. 达尔伯克磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：14190094）
8. Dulbecco's改良的Eagle培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：41965039）
9. 胎牛血清（FCS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10270106）
10. 碳酸氢钠（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：25080060）
11. L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25030024）
12. HEPES（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15630056）
13. 青霉素/链霉素（P / S）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140148）
14. 丙酮酸钠（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11360039）
15. 培养基（见食谱）
体内工作
1. Eppendorf安全锁管1.5 ml（Eppendorf，产品目录号：0030120086）
2. 用于皮下注射的注射器+针头（VWR，目录号：BDAM303176）
3. 针头容器（Sharpsafe，目录号：41602432）
4. 台式表面保护器（VWR，产品目录号：115-9220）
5. Earmarks（Bioseb，目录号：EP-1005-1）
6. 塑料饲养管，20 G x 30 mm，无菌（Instech Laboratories，目录号：FTP-20-30）
7. 无菌1毫升注射器，适合饲管（VWR，目录号：612-0106）
8. 塑料容器暂时限制鼠标
9. 耳标（Bioseb，产品目录号：EP-1005-1）+涂药器（Style 1005s1）
10. 来自BK Universal，UKCR6株的I型和II型干扰素受体敲除AG129小鼠（129 / Sv小鼠）
11. 2' - 甲基胞苷（2CMC，Carbosynth，目录号：NM07918）
12. Favipiravir（T-705，BOC Sciences，目录号：B0084-463609）
13. 羧甲基纤维素（CMC，Sigma-Aldrich，目录号：C9481）
14. 无菌盐水（NaCl 0.9％，B.Braun）
病毒RNA量化
1. 0.2 ml（Eppendorf，目录号：0030089413）的Multipette尖端
2. Lightcycler 480-多孔板96（Roche Molecular Systems，目录号：04729692001）
3. RNeasy Mini试剂盒（QIAGEN，产品目录号：74106）
4. 绝对乙醇（Fisher Scientific，目录号：10342652）
5. iTaq Universal Probes One-Step Kit（Bio-Rad Laboratories，目录号：1725141）
6. 引物，探针和标准（Baert et。，2008）

设备

A-2动物设施中的生物安全罩
BSL-2实验室的生物安全罩
培养箱（37℃，5％CO 2，潮湿）
秤称重老鼠
镊子适合捡起鼠标粪便（可高压灭菌）
移液器组（P10，P100，P1000）
Pipetboy（Integra Biosciences，目录号：155016）
Multipette M4（Eppendorf，产品目录号：4982000012）
多道移液器（Eppendorf，目录号：3122000035）
-80°C冷冻机
PCR工作站
涡流
用一个适合1.5毫升管的转子离心。
用一个适合50毫升管子的转子离心。
高压灭菌器
RT-qPCR机器（Roche Diagnostics，型号：Roche LightCycler 96）
倒置光学显微镜
细胞计数器

软件

GraphPad Prism软件，第7版
LightCycler 96 SW 1.1软件

程序

扩增和量化MNV.CR6病毒库存
注意：培养和感染BSL-2实验室生物安全罩下的细胞
1. 使用细胞刮刀将RAW264.7细胞分裂，在含有40ml 10％培养基的T150烧瓶中以1:10的比例每周一次。将细胞保持在5％CO 2和37℃的CO 2培养箱中。
2. 在培养2或3天后用MNV.CR6感染RAW264.7细胞（即，当细胞几乎汇合但不长满时）。这样做如下：
  1. 从细胞中吸出生长培养基，用DPBS洗涤并吸出DPBS。
  2. 向细胞中加入1ml MNV.CR6并均匀分布，在37℃孵育1小时。
  3. 加入20毫升2％培养基，并将培养瓶放回培养箱中，直至观察到完全细胞病变效应（感染后±2-3天）。
3. 重复两次冻融循环（-80℃对37℃），然后在离心（10分钟，1,500×gg）后收集含有病毒的上清液并以等分试样（500-1,000μl ）在-80°C的低温管中。
4. 如先前Reed等人（1938）所述，通过终点滴定确定病毒滴度。该程序基于通过显微镜检测细胞病变效应（CPE）。
  注意：滴定可以用更高的稀释度系列进行，也可以在病毒储存较强时在第二个96孔板上进行。
  1. 在室温下解冻MNV.CR6库存。
  2. 在96孔板的所有孔中加入100μl2％DMEM
  3. 在96孔板第二柱的B2-G2孔中加入50μl纯病毒原液。
  4. 用多通道移液器匀浆病毒和培养基
  5. 取50μl混合物并转移到下一个孔中。
  6. 重复步骤A4d-A4e，直到达到96孔板的第9栏。
  7. 将第10行的病毒和培养基均质化并丢弃50μl。
  8. 在2％DMEM中以100μl终体积加入10,000个RAW 264.7细胞/孔，至内部60个孔。
  9. 在37℃5％CO 2中孵育72小时。
  10. 将孔与感染细胞（第2-9列）与未感染细胞（第10-11列）比较，并用显微镜评估细胞病变效应（CPE）。
  11. 用Reed-Muench公式计算TCID 50（Reed等人，1938）。
在小鼠中口服MNV.CR6
注意：
1. 在尽可能靠近特定病原体（SPF）设施的条件下，在A-2动物设施的生物安全罩下处理感染动物。
2. 使用防护工作服来防止生物安全罩受到病毒污染。
3. 替换不同实验组之间的手套。
4. 对于所有实验，小鼠年龄和性别匹配，小鼠为8-12周龄。
1. 使用唯一编号标记每只鼠标的耳朵。
2. 解冻病毒并在2％培养基中稀释至MNV.CR6的106 CCID50（50％细胞培养感染剂量）。
  通过口服灌胃给每只小鼠200μl病毒（见下文）。
3. 填充注射器和饲管中的病毒并去除所有气泡。
4. 小心地将鼠标从尾巴的底部拿起，放在电线笼上。
5. 另一方面，通过握住拇指和食指之间的颈背来限制鼠标。将小尾巴放在小手指和无名指之间，以拉伸鼠标（图1）。＆nbsp;
  
  图1.正确的手部位置可容纳一只用于灌胃的小鼠
6. 现在轻轻地将饲管垂直向下插入食道，并以稳定的动作施用病毒（图2）。任何阻力感觉都表示喂食管放置不当，在这种情况下，取出喂食管并重新定位。
  
  图2.饲养管垂直插入小鼠的食道
小分子抑制剂的管理
备注：
1. 在尽可能接近SPF设施的条件下，在A-2动物设施的生物安全罩下处理感染动物。
2. 使用防护工作服来防止生物安全罩受到病毒污染。
3. 替换不同实验组之间的手套。
皮下注射2' - 甲基 - 乙基胞苷（100mg / kg /天）
1. 在无菌生理盐水中溶解2CMC
2. 注入病毒并清除所有气泡。
3. 将鼠标放在尾巴的底部，并将其放在电线笼上。
4. 将针平行于鼠标背面的皮肤插入。确保你只是在皮肤下面（图3）。＆nbsp;
  
  图3.在鼠标背部皮下注射
5. 通过皮下途径用2CMC注射小鼠并以最终浓度为100mg / kg /天的体积（〜200μl）进行稳定运动。
  
  口服强力霉素（T-705）（200 mg / kg / day）
6. 溶解0.4％CMC中的T-705
7. 通过口服灌胃施用适量的T-705，其体积（〜200μl）终浓度为200mg / kg /天。
跟进和收集粪便＆nbsp;
备注：
1. 在尽可能靠近SPF设施的条件下，在A-2动物设施的生物安全罩下处理感染动物。
2. 使用防护工作服来防止生物安全罩受到病毒污染。
3. 净化不同实验组之间的盒子，镊子和刻度。
1. 每天评估动物的一般状况并检查整体健康状况（体重，行为，皮毛）。如果动物达到确定的人道终点（在1-2天内失去超过15％的体重或总体体重> 20％或显示明显的痛苦迹象[嗜睡，眼睛斜视，脱水，驼背] ），必须根据欧洲指导方针（Dir。2010/63 / EU）进行人道安乐死。
2. 等待排便时，将每只小鼠单独放入干净的塑料容器中。
3. 使用镊子收集一块粪便，并将其放置在标记为1.5毫升的管中（图4）。对所有老鼠重复。
  
  图4.标记管中粪便样本的收集
4. 根据下表对粪便样本的一致性进行评分。
5. 将粪便样品存放在-20°C或-80°C的冷冻箱中。
从粪便样品中提取病毒RNA
注意：在BSL-2实验室的生物安全罩下处理感染样本。
1. 用QIAGEN的RNeasy mini试剂盒提取病毒RNA：
  1. 加入400μl的RLT缓冲液到每个粪便样本
  2. 旋转样品，直到粪便样品完全均匀。
  3. 以10,000gxg旋转管3分钟。
  4. 转移350μL的上清液到一个新的1.5毫升管，并加入350μL的70％乙醇。
  5. 根据制造商的协议继续。
2. 用50μl无RNase的水洗脱病毒RNA。
3. 将病毒RNA储存在-20°C冰箱中。
通过RT-qPCR定量病毒RNA
注：在PCR工作站中准备用于RT-qPCR的混合物。
1. 准备正确浓度的引物，探针和标准稀释液（108到100个RNA拷贝）。
2. 解冻一步iTaq Universal Probes试剂盒的病毒RNA样本和组件
3. 为每个样品准备一步RT-qPCR混合物，总共16μl，包含：10μliTaq Universal Probes反应混合物，0.5μliScript高级逆转录酶，无RNase水，900 nM MNV引物和200 nM MNV探测。
4. 轻轻旋转并短暂离心混合物。
5. 在96个RT-qPCR孔板的每个孔中，吸取16μl混合物（使用多重吸管）并加入4μl病毒RNA。
6. 用塑料密封件正确关闭RT-qPCR平板
7. 将RT-qPCR平板置于LightCycler中，并在以下循环条件下运行：在50℃下逆转录10分钟，在95℃下初始变性3分钟，随后进行40个循环的95℃变性15秒，在60℃退火和延伸30秒。
8. 对于绝对定量，使用具有已知浓度的MNV DNA标准品的10倍稀释系列。

数据分析

使用标准曲线和LightCycler 96 SW 1.1软件确定RNA提取物的病毒RNA拷贝数。每克粪便的病毒RNA拷贝数量可以通过在提取前称量粪便样品来计算。使用Prism 7软件进行统计分析，用非参数Mann-Whitney检验确定P值。有关代表详情，请参阅我们的原始出版物（Rocha-Pereira等人，2015年）。

笔记

AG129小鼠（129 / Sv小鼠）最初从英国BK环球公司获得，并根据SPF条件下培育和安置在我们研究所的年度许可协议进行。
所有使用小鼠的实验严格遵循比利时KU Leuven伦理委员会（P101 / 2012）的指导方针并进行。

食谱

RAW264.7电池的培养基

致谢

这里描述的方案的研究以前已经发表（Rocha-Pereira等人，2015）。欧盟FP7项目SILVER（260644），KU Leuven IOF项目HB / 14/031和GOA授予（GOA / 10/014）支持该协议的开发和使用。 J. Rocha-Pereira是Marie Curie COFUND William Harvey国际转化研究学院（WHRI-ACADEMY＃343）博士后研究员。 J. Van Dycke是一位SB博士。法兰德斯研究科学基金（FWO）的研究员。我们非常感谢Herbert W. Virgin教授（美国圣路易斯华盛顿大学）亲切地提供MNV.CR6病毒。我们感谢Carolien De Keyzer，Jasper Rymenants和Charlotte Vanderheydt提供了出色的技术支持。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

Angarone，M. P.，Sheahan，A.和Kamboj，M.（2016年）。诺如病毒移植 Curr Infect Dis Rep 18（ 6）：17.
Aoki，Y.，Suto，A.，Mizuta，K.，Ahiko，T.，Osaka，K.和Matsuzaki，Y。（2010）。诺如病毒排泄的持续时间和诺沃克病毒感染老年病人的病毒载量的纵向过程 J Hosp感染 75（1）：42-46。
Arias，A.，Bailey，D.，Chaudhry，Y.和Goodfellow，I.（2012）。开发用于小鼠诺沃克病毒3的反向遗传学系统：长期持续存在于盲肠和结肠。
Baert，L.，Wobus，C. E.，Van Coillie，E.，Thackray，L. B.，Debevere，J.和Uyttendaele，M.（2008）。使用空斑试验，转染试验和实时逆转录PCR检测鼠诺如病毒1
应用环境微生物学 74（2）：543-546。
Green，K.Y.（2014）。免疫功能低下宿主感染诺如病毒 Clin Microbiol感染 20 （8）：717-723。
Karst，S.M.，Wobus，C.E.，Lay，M.，Davidson，J。和Virgin，H.W。（2003年）。 STAT1依赖先天免疫诺瓦克样病毒科学< / em> 299（5612）：1575-1578。
Murata，T.，Katsushima，N.，Mizuta，K.，Muraki，Y.，Hongo，S.and Matsuzaki，Y。（2007）。婴儿或6个月以下的婴儿因胃肠炎持续感染诺如病毒。 Pediatr Infect Dis J 26（1）：46-49。
Nice，T.J.，Strong，D.W.，McCune，B.T.，Pohl，C.S。和Virgin，H.W。（2013）。小鼠诺沃克病毒NS1 / 2的单氨基酸改变足以促进结肠取向和持久性。
Reed，L.J。和Muench，H。（1938）。估计百分之五十端点的简单方法。 Am J Epidemiol 27（3）：493-7。
Rocha-Pereira，J.，Van Dycke，J.和Neyts，J。（2015）。用核苷聚合酶抑制剂治疗可减少粪便中诺如病毒的脱落，达到检测不到的水平，耐药变异体抗菌剂Chemother 60（3）：1907-1911。
Strong，D. W.，Thackray，L. B.，Smith，T. J.和Virgin，H. W.（2012）。衣壳蛋白的突出结构域对于确定鼠类诺沃克病毒复制和发病机制在体内是必要和充分的。 J Virol 86（6）：2950-2958。
Thackray，L.B.，Wobus，C.E.，Chachu，K.A.，Liu，B.，Alegre，E.R。，Henderson，K.S.，Kelley，S.T。和Virgin，H.W。（2007年）。尽管序列分歧有限，但由单个基因组组成的鼠诺沃克病毒表现出生物多样性。 J Virol 81（19）：10460-10473。
Westhoff，T.H.，Vergoulidou，M.，Loddenkemper，C.，Schwartz，S.，Hofmann，J.，Schneider，T.，Zidek，W。和van der Giet，M。（2009）。肾移植受者的慢性诺如病毒感染 Nephrol Dial Transplant > 24（3）：1051-1053。
Wobus，C.E。，Karst，S.M.，Thackray，L.B.，Chang，K.O.，Sosnovtsev，S.V.，Belliot，G.，Krug，A.，Mackenzie，J.M.，Green，K.Y。和Virgin，H.W。（2004）。诺如病毒在细胞培养中的复制揭示了树突状细胞和巨噬细胞的趋向性。 > PLoS Biol 2（12）：e432。