材料和试剂

移液器吸头（20μl-1 ml，高压灭菌）
铝箔
1.5和2毫升Eppendorf管（高压灭菌）
0.45μm过滤器
蓝细菌<集胞藻> sp。 PCC 6803（WT，突变体D95和C95）
注意：有关这些菌株的更多信息，请参阅数据分析A4。
硫酸（ACS试剂，Sigma-Aldrich，目录号：S1526）
氮
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：362808-1L）
糖原（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：R0561）
淀粉葡糖苷酶（Sigma-Aldrich，目录号：10115-1G-F）
碳酸钠（Na 2 CO 3）（Sangon Biotech，目录号：ST0840）
硝酸钠（NaNO 3）（国药集团化学试剂，目录号：10019918）
盐酸（HCl）（国药集团化学试剂，目录号：10011018）
氢氧化钠（NaOH）（Sangon Biotech，目录号：SB0617）
磷酸氢二钾（K 2 HPO 4）（Sangon Biotech，目录号：PB0447）
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O）（Sangon Biotech，目录号：MT0864）
硫酸铁铵（Sangon Biotech，目录号：A502657）
柠檬酸（Sangon Biotech，目录号：C0529）
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（Sangon Biotech，目录号：CT1331）
EDTA-Na 2（Sangon Biotech，目录号：E0105）
硼酸（H 3 BO 3）（Sangon Biotech，目录号：BB0044）
氯化锰（II）四水合物（MnCl 2·4H 2 O）（Sangon Biotech，目录号：A500331）
硫酸锌七水合物（ZnSO 4·7H 2 O）（Sangon Biotech，目录号：A602906）
脱水钼酸钠（Na 2 MoO 4·2H 2 O）（Sangon Biotech，目录号：SB0865）
硫酸铜（II）五水合物（CuSO 4·5H 2 O）（Sangon Biotech，目录号：A501425）
硝酸钴（II）六水合物（Co（NO 3）2·6H 2 O）（Sangon Biotech，目录号：CB7774） />
无水硫代硫酸钠（Na 2 S 2 O 3）（Sangon Biotech，目录号：S1712）
D-葡萄糖（Sangon Biotech，目录号：501991）
葡萄糖标准溶液（Sigma-Aldrich，目录号：G3285）
苯甲酸（国药集团化学试剂，目录号：30018615）
葡萄糖氧化酶/过氧化物酶（Sigma-Aldrich，目录号：G3660）
- 茴香胺试剂（Sigma-Aldrich，目录号：D2679）
氢氧化钾（KOH）（Sigma-Aldrich，目录号：P6310）
乙酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S2889）
TES，N-三（羟甲基）甲基-2-氨基乙烷磺酸（Sangon Biotech，目录号：TB0927）
BG-11媒体（见食谱）
D-葡萄糖（见食谱）
分析试剂（见配方）
30％（w / v）KOH（见食谱）
100 mM乙酸钠（pH 4.5）（见食谱）

设备

锥形瓶（100,200,500毫升）（顺秋，成都，中国）
涡流（FINE PCR，型号：Finevortex）
离心机，未冷冻，最大速度17,000 emg，带微管转子（Thermo Fisher Scientific，型号：Heraeues TM Pico TM 17） />
玻璃试管18 x 150 mm
分光光度计（METASH，型号：V-5600）
1毫升玻璃比色皿（METASH）
移液器（20μl，200μl，1ml，5ml）（法国吉尔森）
水浴（温度设定在37±1℃; 60℃; 92℃）（Meier，型号：XMTD-204）
摇动光照培养箱（光照：150微摩尔/平方米/秒;温度：20-50℃）（上海知初，型号：ZQWY-200G）
冷冻干燥机（Labconco，型号：FreeZone Plus 6）
烤箱，60°C（Boxun，型号：GZX-9140MBE）
高压灭菌器（Boxun，型号：YXQ-LS-100SII）
pH计（Mettler Toledo，型号：FE 20）
游泳池

软件

GraphPad PRISM（版本5.01）

程序

蓝藻培养
1. 蓝细菌（集胞蓝细菌）细胞原种保持在20％甘油中-80℃。在100ml锥形瓶中加入〜100μl冷冻原料至50ml BG-11培养基（见配方1）。在白光（25μmolm -2 s -1）下培养起始培养物3-4天（直到OD 730约为0.5））在30℃的轻度培养箱中以150rpm振荡。为了进行葡萄糖消耗和糖原估计实验，在具有0.1的初始OD 730的200ml锥形瓶中在100ml BG-11培养基中进行新鲜培养，并在光孵化器中在相同温度下孵育上述条件。
2. 当OD 730约为0.4（通常需要约36小时）时，向100ml培养基中加入1ml（0.5M）无菌D-葡萄糖溶液（参见配方2）以获得最终葡萄糖浓度为5mM。在两种条件下培养培养物：（1）暗葡萄糖条件，其中锥形瓶用铝箔包裹;以及（2）在光 - 葡萄糖条件下，锥形瓶不包裹在箔中。
  每24小时收集一次葡萄糖和糖原测量样本
3. 对于每2ml收集物，将其转移到2ml Eppendorf管中，使用分光光度计测量OD 730，并记录它。在室温下将2ml样品在17,000gxg离心2分钟，并将上清液转移到单独的2ml Eppendorf管中。上清液用于测定葡萄糖，其余用于测定糖原（糖原测量部分更详细）。
胞外葡萄糖测量
1. 来自步骤A3的样品用于测定葡萄糖（表1）
  
  表1.细胞外葡萄糖测试的实验设计
  
  注：我们采取5种生物＆amp;每个实验3次技术重复。
2. 打开分光光度计。向每个管中加入2 ml检测试剂（见配方3）。通过涡旋彻底混合。将500μl样品和标准品加入比色杯中，并测量540nm处的空白吸光度。记录为“初次阅读”。
3. 将管放置在37℃的水浴中正好30分钟。加入2ml 12N H 2 SO 4 4以终止反应; （为了安全起见，在化学罩中添加酸），并通过涡流充分混合并充分混合。为了获得确切的孵育时间，保持空白，标准和测试样品的移液间隔为30-60秒。葡萄糖的存在导致粉红色的发展（图1A和1B）。样本中的葡萄糖越多，粉红色看起来就越强。
4. 在对照空白30分钟后测量540处的OD，并记录为“最终读数”。
  注意：步骤B4应该在步骤B3之后立即执行。时间间隔应保持严格相等。
图1.来自生长培养基的细胞外葡萄糖的定量测定对于WT（图A）和突变的蓝细菌（图B）显示了三个重复。原则上，葡萄糖被葡萄糖氧化酶氧化成葡萄糖酸和过氧化氢。过氧化氢然后在过氧化物酶的存在下与还原的茴香胺反应以形成棕色的氧化的茴香胺。氧化 - 茴香胺与硫酸反应形成更稳定的粉红色产品。在540nm测量的粉红色的强度与原始葡萄糖浓度成比例。因此，粉红色表示存在葡萄糖，而白色/透明颜色表示非常少的葡萄糖。结果也可在Khan et al。，2016中找到。
糖原测量
1. 使用步骤A3中收集的样本。按照以下方式计算来自OD <730>值的近似细胞数目; 1.0的OD值730可以取为1.03×10 8个细胞/ ml。从野生型和突变体集胞蓝细菌培养物中分别以1700gxg离心约3×10 9个细胞2分钟。去除上清液。每次用1ml无菌ddH 2 O洗涤沉淀两次。立即将细胞沉淀移至-80°C 5分钟以停止代谢。
2. 接下来，在连续氮气流下，将细胞沉淀置于-70℃冻干机中过夜。在第二天，在冻干机中干燥〜14小时后，称重干燥的细胞沉淀并记录重量。
3. 将干燥的细胞沉淀重悬于1ml 30％（w / v）的KOH中（见配方4）。
  完全混合移液（3至5分钟）
4. 将混合物置于97°C水浴中2小时，用游泳架（提前设置水浴以确保温度正确）。
5. 将1毫升30％的KOH悬浮样品分成两个单独的Eppendorf管，每个管都有500μl。加入约1.3 ml冰冷的乙醇至最终浓度为70-75％。
  冰上孵育2小时
6. 在室温下将混合物在17,000×gg下离心2分钟。取出上清液时小心不要打扰管底部的颗粒。用98％乙醇洗涤沉淀三次。
  在Eppendorf管底部看到的颗粒是糖原。
7. 打开Eppendorf管盖，置于60°C烘箱中10-20分钟（取决于完全干燥需要多长时间）。
8. 用0.5ml 100mM乙酸钠（pH 4.5）重悬干燥的沉淀（参见配方5）。如果两个试管含有相同的样品（在步骤C5中分成），则它们可以加在一起得到1ml的体积。将固定量的糖原（0.005mg）溶解在1ml 100mM乙酸钠（pH 4.5）中。这是STD glyc 。
9. 在步骤C8中获得的1ml悬浮液中添加2mg淀粉葡糖苷酶（终浓度2mg / ml）。在60°C水浴中孵育2小时。淀粉葡萄糖苷酶将糖原水解成葡萄糖。
10. 按照'程序B'中描述的步骤B4至B7测量葡萄糖。

数据分析

胞外葡萄糖测量
1. 计算标准（ΔA<540> STD）和测试样品（ΔA<540>样品）的'最终读数'和'初始读数'之间的差异。葡萄糖的量可以使用下面的公式计算：
  Mg葡萄糖=（ΔA540样品）×（0.05ml标准溶液中的葡萄糖量/ΔA540STD）。
2. 将获得的葡萄糖的量转化为mMol，并通过除以步骤A3中记录的OD 730得到标准化。对于每个样本，我们使用五个生物和三个技术重复。
3. 打开GraphPad PRISM（版本5.01）软件（软件界面如图2所示）。从'New Graph＆amp;'选择'分组'表'列表。从'Sample data'选项中选择'从一个空数据表开始'。从“选择图表”选项中选择“交叉条形，垂直”。从'Y subcolumns for replicates or error bars'选项中，选择5个重复的'Enter'。从'Plot'选项中选择'Mean with SEM'，然后点击'创建'。
  
  图2. GraphPad PRISM软件的界面
4. 一个页面将在单个标题A（A：Y1，A：Y2，A：Y3，A：Y4，A：Y5）下的顶部打开5个空框。标有1,2,3,4等的标题将出现在左边。将标题“A”的标签替换为“WT”，“B”替换为“D95”和“ C“和”C95“。左侧标题系列标有相应的时间点：0 h，24 h，等。三个技术重复的平均值放在框中，五个生物重复有五个框。同样，D95和C95的数据也放在标题为D95和C95的框中。 D95是其中<！ - SIPO - > slr089 基因已被缺失的突变体，导致该突变体与野生型相比对葡萄糖代谢具有不同的响应。 C95是一种内源性基因被删除的菌株，但它与另一种与不同的抗生素抗性标记连锁的野生型版本的 slr089 基因互补，删除菌株D95中的 slr089 基因。 C95具有野生型葡萄糖代谢活性。点击页面顶部的“分析”选项进行分析。点击左侧的“结果”选项即可查看统计信息。点击页面左侧的“图表”选项即可查看图表。图3A可以通过右击并选择复制来复制。
  
  图3.来自蓝细菌的野生型和不同突变株的细胞外葡萄糖（A）和糖原（B）估计的数据分析和呈现，集胞藻属（Synechocystis sp。） PCC 6803 （详见数据分析A4）。结果发表在科学报告中，关于突变体的更多信息可以在Khan et。（2016）中找到。
反应的示意图：
来自蓝细菌的糖原测量
1. 使用以下公式计算糖原的量：
  测试样品中糖原的量（mg）=（测试样品的葡萄糖量）x（0.005 /从STD glyc获得的葡萄糖的量）。
  计算的糖原量乘以1,000，将单位从mg转换为μg。
2. 以μg计算的糖原通过除以步骤C2中测量的干重（过程部分）而归一化。为了获得可靠的数据，我们对每个样品使用五种生物和三种技术重复，包括糖原标准（STD glyc ）。在步骤C1中使用之前，我们获得从STD glyc复制品获得的平均葡萄糖。
3. 在数据分析部分的步骤A3至A5之后进行统计分析，样本结果如图3B所示。

食谱

BG-11媒体准备
1. 步骤1：储备溶液根据表2给出的基于Stainer等报道的溶液制备。（1971年）。高压灭菌的库存解决方案。用铝箔包装纸3以免光照。
  在室温下储存储备溶液
  表2. BG-11媒体组成
2. 步骤2：准备1 L培养基，每只股票加1 ml。接下来，加入0.02g / L的Na 2 CO 3和1.5g / L的NaNO 3。
  使用盐酸（HCl）和氢氧化钠（NaOH）将pH调节至约7.5
3. 第3步：使用液体介质循环将介质倒入锥形瓶和高压灭菌器。
D-葡萄糖
将1.350克D-葡萄糖溶解在15毫升的dH 2 O中，制成0.5毫升的原液。
使用0.45μm过滤器消毒
分析试剂

添加0.8毫升的茴香胺试剂到含有39.2毫升葡萄糖氧化酶/过氧化物酶试剂的琥珀色瓶中多次翻转瓶子混合
尽量减少曝光

该解决方案在2-8°C时可稳定长达1个月如果浑浊发展或颜色形式丢弃
30％（w / v）的KOH制剂
将15克KOH溶解在50毫升ddH2O中以制备30％（w / v）的KOH溶液
在室温下储存
100 mM醋酸钠制剂
将0.4102克醋酸钠溶于50毫升水中，使终浓度达到100毫摩尔
使用NaOH或HCl将pH调整至4.5
在室温下储存

致谢

该协议是Grundel et al。（2012）描述的方法的改进版本。这项工作得到了973计划（2011CBA00803），国家自然科学基金（31671504,81421061）和国家重点科技研发计划（2012BAI01B09）的支持。
作者声明不存在任何利益冲突或利益冲突。

参考

Anderson，S.L。和McIntosh，L。（1991）。蓝藻集胞藻的光激活异养生长 sp。应变PCC 6803：需要蓝光的过程。 J Bacteriol 173（9）：2761-2767。
Bloye，S.A.，Silman，N.J.，Mann，N.H。和Carr，N.G。（1992）。集胞藻的碳酸氢盐浓度 PCC6803：调节蛋白质磷酸化和无机碳运输通过葡萄糖。植物生理学 99（2）：601-606。
Grundel，M.，Scheunemann，R.，Lockau，W。和Zilliges，Y。（2012）。受损的糖原合成引起代谢溢流反应并影响蓝藻集胞的应激反应 sp。 PCC 6803. 微生物学 158（Pt 12）：3032-3043。
Kaplan，A。和Reinhold，L。（1999）。 Co2在光合微生物中的浓缩机制 Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 50：539-570。
Khan，R. I.，Wang，Y. S.，Afrin，S.，Wang，B.，Liu，Y.，Zhang，X.Q.，Chen，L.，Zhang，W.W.，He，L.and Ma，G.（2016）。转录调节因子PrqR在葡萄糖代谢和氧化应激适应<集胞蓝细菌 sp。中扮演负面角色。 PCC 6803. Sci Rep 6：32507.
Lee，S.，Ryu，J.Y.，Kim，S.Y.，Jeon，J.H.，Song，J.Y。，Cho，H.T.，Choi，S.B。，Choi，D.，de Marsac，N.T.and Park，Y.I。（2007）。蓝藻集胞藻呼吸基因的转录调控 sp。 PCC 6803在对葡萄糖喂养的早期反应中。植物生理学 145（3）：1018-1030。
Nagarajan，S.，Srivastava，S.和Sherman，L. A.（2014）。质粒hik31操纵子在调控集胞藻黑暗中的中央代谢中的重要作用 EM> SP。 PCC 6803. Mol Microbiol 91（1）：79-97。
Narainsamy，K.，Cassier-Chauvat，C.，Junot，C.和Chauvat，F.（2013）。通过与LTQ-Orbitrap质量耦合的液相色谱对蓝藻代谢进行高效分析光谱仪：证明葡萄糖重新编程整个碳代谢并触发氧化应激。代谢组学 9（1）：21-32。
Ryu，J.Y.，Song，J.Y.，Lee，J.M.，Jeong，S.W.，Chow，W.S.，Choi，S.B。，Pogson，B.J.and Park，Y.I。（2004）。葡萄糖诱导的黑素中类胡萝卜素生物合成基因的表达是由蓝细菌中的细胞质pH介导的> Synechocystis sp。 PCC 6803. Biol Chem 279（24）：25320-25325。
Takahashi，H.，Uchimiya，H。和Hihara，Y。（2008）。集胞藻的光合自养和光混合营养培养物代谢物水平的差异 PCC 6803通过毛细管电泳电喷雾电离质谱测定。 J Exp Bot 59（11）：3009-3018。
Stanier，R.Y.，Kunisawa，R.，Mandel，M.和Cohen-Bazire，G.（1971）。单细胞蓝藻的纯化和特性（订购Chroococcales）。 Bacteriol Rev 35（2）：171-205。