材料和试剂

1.5 ml微量离心管（可由任何科学分销商销售）
用于培养2-5毫升酵母和细菌培养物的玻璃或一次性圆底无菌试管（可由任何科学经销商出售）
塑料培养皿（可由任何科学分销商出售）
PCR管
牙签
酵母菌株（表1）

表1.应变列表
质粒（表2）

表2.质粒
电子。大肠杆菌感受态细胞（DH5α）（如所述制备，例如， https://www.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells 或可以从新英格兰生物实验室购买）
注意：我们使用CaCl 2 处理过的DH5α，但可以购买。
甘油（任何来源）（在H 2 O中50％，高压灭菌）
鲑鱼精子DNA（Sigma-Aldrich，目录号：D1626; 10mg / ml，超声处理并煮沸）
Sap I（新英格兰生物实验室，目录号：R0569S）
Cla（I）（New England Biolabs，目录号：R0197S）
小牛肠磷酸酶（CIP）（新英格兰生物实验室，目录号：M0290L）
定制的寡核苷酸（长度在18-60个核苷酸之间，Eurofins MWG Operon，Alabama）
T4多核苷酸激酶（New England Biolabs，目录号：M0201S）
T4连接酶（New England Biolabs，目录号：M0202L）
2x YT（请参阅 https://www.elabprotocols.com/protocols/#!protocol=5436配方）（+100μg/ ml氨苄青霉素）液体培养基和培养板（细菌选择）
氨苄青霉素（任何来源）
Taq 聚合酶（任何来源）
聚乙二醇（PEG）3350（Sigma-Aldrich，目录号：P4338）
醋酸锂（任何来源）
Nco I或 Stu I
尿苷（任何来源）
0.2％SDS
琼脂糖（任何来源）
Qiaquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28706）
磅
1. 酵母提取物（BD，Bacto TM，目录号：212750）
2. 胰蛋白胨（BD，Bacto TM TM，目录号：211705）
3. 氯化钠（NaCl，认证ACS等级≥99.0％）（Fisher Scientific，目录号：S271）
YPD
1. 酵母提取物（BD，Bacto TM，目录号：212750）
2. 蛋白胨（BD，Bacto TM，目录号：211677）
3. 葡萄糖（Fisher Scientific，目录号：D16）
  注意：在蒸馏水中制成20％的原料。
缺乏尿嘧啶的合成葡萄糖（SD-URA）液体培养基和平板（尿嘧啶原养型酵母选择）（参见 http://cshprotocols.cshlp.org/content/2015/2/pdb.rec085639.short ）
1. 细菌琼脂（用于盘子）
2. 葡萄糖（Fisher Scientific，目录号：D16）
  注意：在蒸馏水中制成20％的原料。
3. 酵母氮碱无W / O氨基酸W /硫酸铵（BD，目录号：291940）
4. 所有氨基酸，嘌呤和嘧啶（任何来源）
SD-complete + 5'FOA（
细菌琼脂
葡萄糖（Fisher Scientific，目录号：D16）
注意：在蒸馏水中制成20％的原料。
尿嘧啶
酵母氮碱无W / O氨基酸W /硫酸铵（BD，目录号：291940）
5-氟乳清酸（5-FOA）（奥克伍德产品，目录号：003234）

设备

移液器（能从1μl-10 ml准确移液）（任何来源）
热循环仪（MJ Research，型号：PTC-200）
涡（任何来源）
微型离心机能够14kG（Eppendorf）
加热块（37°C，44°C）
培养箱（30°C，37°C）
DNA凝胶电泳仪
紫外透射仪（或手持式紫外灯）
摇床培养箱（或滚筒）（30°C，37°C）
介质灭菌设备（高压灭菌器或压力锅）

程序

整个过程需要在染色体中鉴定合适的靶位点，设计gRNA寡核苷酸并将其连接到gRNA表达质粒中，设计和构建供体修复片段，将gRNA质粒和修复片段共转化到酵母中，最后，筛选和验证突变株。
按照下面列出的时间表来描述每个步骤的详细协议。
单基因敲除的基本方案/时间线
第1-2天。设计和排序寡核苷酸（参见程序A）

3对不同的gRNA靶标（如果可能的话，靶向起始ATG上游150个碱基的启动子区域中的一个PAM）（〜23个碱基/寡核苷酸）。
2个用于供体修复片段的寡核苷酸（〜60个碱基/引物）。
2个寡核苷酸（正向和反向）用于基因分型。＆nbsp;

制备gRNA质粒和修复片段（见程序B，C和D）

退火并填写供体修复片段。
退火并将编码gRNA的寡核苷酸连接到SapI消化的和去磷酸化的载体中。
转换成 E。大肠杆菌感受态细胞。＆nbsp;

确认质粒插入（见程序B）

培养细菌并制备gRNA质粒（37°C孵育6-8小时）。
检查gRNA质粒是否存在ClaI位点的缺失。
消化用于酵母转化的StuI。
为第二天转化放置过夜酵母培养物。

第6-7天。 C。白色念珠菌转化（见程序E）

稀释酵母培养物1:20进行转化（在30°C孵育5小时）。
转换成 C。白色的。

第9-10天。基因型突变体（见程序F和G）

通过PCR分析Ura <+>转化体
划出单个菌落以避免混合突变体，通过PCR重新检查，然后储存2-3个突变株。

设计和订购gRNA，敲除验证寡核苷酸
1. 确定您想要进行诱变的基因或DNA区域，并找到合适的gRNA靶序列。对于Cas9切割的要求是紧邻约20个碱基对目标下游的PAM序列（5'-NGG-3'）的存在。这个5'-NGG-3'可以在任一DNA链上。这个序列在 C中必须是唯一的。白色念珠菌基因组以防止脱靶切割。一个有用的网站用于识别和排列合适的gRNA，是CHOP CHOPv2（ http://chopchop.cbu.uib.no / ）（Labun等人，2016年）。一般而言，我们坚持使用本网站获得的PAM网站的排名来指导目标网站的选择。
2. 需要对应于20bp双链序列的两个互补寡核苷酸。每个寡核苷酸的长度为23个碱基，并且在其5'末端还必须包含适当的序列以提供粘性末端用于将退火的dsDNA直接连接到用SapI切割的pND494或pND501中（图1）。选择使用哪种载体是基于后续实验是否需要尿嘧啶原养型或营养缺陷型菌株。如果需要尿嘧啶营养缺陷型，pND501允许回收 Ura - 基因型（见程序H）。将这些退火的寡核苷酸连接到其中的克隆盒（参见下面的图1）已被设计为允许与上游tRNA序列和下游tracrRNA两者的精确融合（Ng和Dean，2017）。该整个tRNA-sgRNA-HDV序列由pND494和pND501载体中的ADH1启动子驱动（图1A）。最终的结果是表达侧翼与tRNA和核酶的sgRNA用于精确的转录后加工以产生合适的5'和3'末端。
3. 图1描绘了gRNA表达载体图谱（A）和两个互补的gRNA寡核苷酸（B）的设计实例。图1B中的顶部序列描述了pND494 / 501表达载体中存在的含Cla I的Sap I盒。下面的序列描述了退火和连接到该盒中后编码gRNA的寡核苷酸。此实例显示双链体编码LEU2基因特异性gRNA的连接，盒装序列指示合成的每种寡核苷酸。＆nbsp;
  
  图1.如何设计用于表达克隆的编码gRNA的寡核苷酸pND494和pND501克隆载体（图A）含有设计用于退火直接连接的SapI I克隆盒gRNA寡核苷酸（图B）。上部DNA双链体（B）中显示了SapI I克隆盒的DNA序列。下面显示的是连接编码靶向gRNA的LEU2靶标的双链退火寡核苷酸的实例（来自Ng和Dean，2017）。区域中的方框表示每个寡核苷酸的序列。注意每个23个碱基的寡核苷酸包含突出端序列，该突出端序列与用SapI消化的载体的粘附端结合。由于 Sap I的切割是非回文的，载体的重新连接是不可能的，因此大大减少了假阳性E的背景。大肠杆菌转化子（C4）。
4. 当订购gRNA寡核苷酸时，我们通常靶向3个不同的PAM位点（其需要6种不同的gRNA寡核苷酸），因为gRNA依赖性CRISPR诱变的效率以序列依赖性方式变化。针对3个不同的PAM网站最大限度地获得正确的突变体的可能性。实验证据表明，靶向转录起始位点附近的5'近侧区域导致更高的诱变频率（Radzisheuskaya等人，2016）。因此如果可能的话，选择第一个起始ATG甲硫氨酸密码子上游150个碱基（5'）内的一个靶标作为目标位点之一。
  注意：请勿在gRNA寡核苷酸中包含PAM SITE。
5. 设计引物用于验证正确的染色体突变
  为了检查染色体基因缺失，通过基因组DNA的PCR扩增命令两个〜18-30bp的寡核苷酸，正向和反向。如果可能的话，该PCR扩增的产物应小于500bp。这允许PCR扩增时间小于30秒（使用Taq聚合酶），从而最小化验证所需的时间。
创建一个合适的修复模板
修复模板是跨越切割位点的双链DNA片段，具有用于同源重组的足够同源性，并产生适当的突变。除了引入所需的突变之外，修复模板必须缺少PAM网站。否则，目标突破位点将在其修复后重新引入染色体。
用于产生缺失等位基因的最简单的修复模板使用一对60bp的寡核苷酸，其具有〜47bp的同源性（在5'末端）与侧翼于染色体断裂位点的序列，3'末端〜20bp重叠，以及独特的限制位点（例如，见Vyas等人，2015; Ng和Dean，2017）的重叠确认。显示修复策略删除 LEU2 基因（来自Ng和Dean，2017）和修复寡核苷酸序列的示例如图2所示。

图2.用于基因缺失的修复模板的设计用于删除LEU2基因座的供体修复片段合成示意图，靶向在位置137的PAM位点处的断裂（图A）使用图1B中描绘的寡核苷酸。与修复模板同源的染色体序列以红色和绿色着色。每个60聚体寡核苷酸以互补性的3'20bp序列结束，包括在LEU2（Eco EcoRI RI）中不存在的限制性位点，如蓝色所示。当退火和延伸时，该修复片段与DSB侧翼序列具有47bp的同源性。在本例中，取自Ng和Dean，2017，同源重组导致LEU2 的434缺失和独特的EcoRI位点的插入，这简化了假定突变体的基因分型。图B显示每个“修复片段”寡核苷酸的序列及其比对。序列用颜色编码为红色，蓝色和绿色，以指示每个序列的位置，如面板A所示。
将gRNA寡核苷酸克隆到gRNA载体中
pND494或pND501均可用于任何ura3ΔCAS9白色念珠菌菌株中的gRNA表达。如果进一步的表型分析需要URA3 的损失，那么这两个载体的唯一区别是pND501具有可回收的URA3等位基因（Wilson等人，2000） / （见下文）。
1. 消化2微克载体（pND494或pND501）和 Sap I
  DNA
  2微克
  10倍缓冲区
  5微升
  SAP I
  1微升
  H 2 O
  至50微升
  1. 。在37°C孵育5-15分钟以获得快速消化/高保真酶。
  2. 旋转。
  3. 加入1μl小牛肠磷酸酶（CIP）（或南极磷酸酶）。
  4. 在37°C孵育1小时
  5. 用QIAquick Gel Column纯化（不需要在凝胶上运行）;用30μl洗脱缓冲液或TE，pH8.0洗脱。
2. 磷酸化和退火sgRNA寡核苷酸（来自Vyas等人，2015年）。
  1. 加入PCR管中：100μMOligo 1（上图）
    1微升
    100μMOligo 2（底部）
    1微升
    
    10x T4连接酶缓冲液 5微升
    T4多核苷酸激酶
    1微升
    H 2 O
    42微升
    注意：做一个没有寡核苷酸的阴性对照。
  2. 在热循环仪中孵育：
    37°C 30分钟
    95°C 5分钟
    以最慢的升温速率冷却至16°C，机器可以完成（我们的速度为0.1°C /秒）。
3. 退火的sgRNA寡核苷酸的连接
  1. 在PCR管中组装：10x T4连接酶缓冲液＆nbsp;
    1微升
    T4连接酶
    0.5微升
    退火Oligo混合
    0.5μl（包括阴性对照，不含寡核苷酸）
    矢量
    20-40 ng
    H 2 O
    至10微升
  2. 在热循环仪或冷/热块中孵育管：
    16°C 30分钟
    65°C 10分钟
    冷却至25°C
4. 将5μl转化到50-100μl感受态细菌DH5α细胞中。
  在2xYT（或LB）+氨苄青霉素平板上铺板细胞。 37°C孵育过夜;使用任何公开的协议制备质粒DNA。
5. 筛选菌落
  这个协议通常导致〜10-20个菌落，没有单独的切割载体的背景。通过限制性分析来鉴定正确的克隆，筛选通过用gRNA寡核苷酸置换在SapI盒中预测的ClaI位点的缺失（注意，pND494含有单一的 I site，在盒式磁带中，而pND501包含两个 Cla I站点）。任何可能正确的克隆都应通过DNA序列分析进行验证。以下引物对于测序gRNA连接是有用的，特别是如果这些载体将用于多基因敲除。这些引物（参见下面的序列）与侧翼5'-ADH1启动子和3'HDV核酶序列同源。
  
  5'位于tRNA上游的ADH1 下方（-247相对于+1）
  5'GCTTATTCAGAATTTTCAGA 3'
  
  3'（在HDV的3'端包括 Mlu I站点）
  5'-CGAGATGACGCGTGTCCCATTCGCCAT-3'
修理模板的准备
使用〜60点碱基的寡核苷酸与在〜3’ 端的20bp重叠创建修复模板，对象混合寡核苷酸退火和DNA复制，以产生〜100bp的（参见图2）的产物。
每25μl反应：每个寡核苷酸（100毫米股票）
3微升
Taq 聚合酶
0.5微升
dNTP混合物（最终0.2mM）
2.5微升
10倍缓冲区
2.5微升
H 2 O
至25微升
在热循环仪中将管子在94℃20秒，55℃30秒，72℃30秒温育30个循环。

每个酵母转化过程中转化20微升这个反应
℃。白色念珠菌转化
gRNA矢量标有 URA3 进行选择，和 RPS1 以允许整合在染色体 RPS1 与斯图我。质粒线性化的斯图 I（或的Nco 我如果gRNA序列包含一个斯图 I位点），变成了一个Cas9表达的酵母菌株（即，表1中的那些），并在SD（ - Ura）板上选择。
转化应该包括缺乏gRNA质粒的对照，以及只含有亲本载体（缺乏gRNA序列）的对照。供体修复片段的共转化允许双链断裂修复。因为这不能修复断裂是致命的，通常存在至少在修复模板的存在下相比，缺少其时所转化体的数目的两倍的增加。

使用改进后的醋酸锂方案（Walther and Wendlund，2003）进行转化
转化（TF）组合（每次转化）＆nbsp;50％PEG（无菌）
240微升
1 M LiOAc（无菌）
32微升
鲑鱼精子DNA（10毫克/毫升煮沸;保持在冰上）
5微升
质粒DNA（〜10μg，用NcoI或EmI消化）
33微升
捐助者修复片段
25微升
酵母细胞悬液
50微升
总共
360微升
酵母转化协议（用于〜2-3转化反应）
1. 将新鲜菌落接种至YPD +75μg尿苷/ ml。
  在30°C的摇床中培养过夜。
2. 将100μl从过夜稀释到2ml YPD +尿苷中，在30℃振荡4-6小时。
3. 旋转1ml细胞（约5OD单位），用H 2 O洗涤，然后用1ml 0.1M LiOAc洗涤。
4. 在100μl0.1 M LiOAc中重悬（应该显得浓稠）。
5. 将TF混合物，50μl酵母细胞和30μl线性化质粒DNA（〜30μg）或15μlPCR反应物（1-10μg/μl）混合，使总体积为360μl。
6. 在30°C孵育过夜（最多24小时）。
7. 在44°C热冲击15分钟
8. 将整个混合物铺在SD-URA板上。在30°C孵育2-3天。
突变验证
为了鉴定所需的突变体，使用菌落PCR来扩增野生型基因和突变等位基因的侧翼区域。如下分离基因组DNA：＆nbsp;
1. 在〜400μlLB培养基中接种一个含有单个菌落的细胞的牙签并在37℃，220rpm下培养约3小时。
2. 旋转细胞并重悬于30μl0.2％SDS并煮沸4分钟。
3. 细胞离心后，将3μl上清液（含有基因组DNA）加入18.25μl水，2.5μlPCR缓冲液，20μl2.5mM dNTP，1μl各引物（10mM原液）和0.25μlTaq 聚合酶。 PCR条件是94℃0.5分钟，55℃1分钟和72℃1分钟的30个循环。
注意：
1. PCR产物可以通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。强烈建议在进行PCR分析之前，对单菌落划线以避免混合不同基因型菌落的可能性。有关这些分析的示例，请参阅Ng和Dean，2017，图7.
2. 用于验证的寡核苷酸的设计（参见上面的程序C ）应该考虑需要检测大小迁移移位改变比野生型等位基因产生更小的PCR产物。如程序B 中所述，使用引入供体修复片段的独特酶进行限制性消化的易感性对突变验证非常有用。在不可能的情况下，可以通过DNA测序直接筛选PCR产物。在任何一种情况下，应对任何将用于随后的表型分析的突变株进行缺失等位基因的基因组测序。
3. CRISPR介导的突变频率取决于基因座和突变的性质而变化，但是该过程通常导致30-95％的频率范围。一旦获得并验证了突变菌株，在-80℃下在15％甘油中储存来自单菌落的2-3个菌株。
ura3 营养缺陷型菌株的再生
1. 当使用用pND501转化的菌株时，可以通过在含有5-FOA的平板上进行选择来分离丢失了ura3dp1121等位基因的突变体ura3突变体（ http://cshprotocols.cshlp.org/content/2016/6/pdb.rec086637.short ）。在选择5-FOA之前，将新鲜培养基上的突变菌株划出单菌落。
2. 挑取3-4个菌落，并在包含5-FOA的平板上划线。或者，使用新鲜的液体培养物，稀释并消除（循环出现的频率在10 -5中为〜1）。
3. 稀释过夜培养物1：100,1：10,000,1：100,000。在含有FOA的平板上每板稀释100μl。在SD-URA平板上筛选FOA抗性菌落以确认URA3基因的丢失。

数据分析

在酵母转化过程中，重要的是包括以下对照：无质粒DNA（以确保转化体是尿嘧啶原养型，并且SD（ - Ura）平板或转化溶液未被污染）。没有gRNA质粒（为了确保转化子来自gRNA载体摄取），没有供体修复片段。最后一个对照提供了可能由修复片段在靶基因座处的同源重组引起的菌落数量的估计。在存在与不存在愈合片段的情况下产生的集落的倍增刺激可以提供对突变频率的估计。一般而言，我们发现高突变频率导致在存在与不存在修复片段的情况下产生的集落的大的刺激。用这种方法进行突变和修复的频率约为30-90％。应该指出的是，其他几种CRISPR介导的在 C中引入突变的系统。已经描述了白色念珠菌（Vyas等人，2015; Min等人，2016; Nguyen等人，，2017年）。），每个人都有自己的优势和弱点。希望随着这些方法被更频繁地使用，对C进行简单的遗传分析。白种人将成为常态。

致谢

该协议主要适用于Ng和Dean，2017年。作者没有利益冲突或利益冲突。 HN得到石溪大学URECA-生物学校友研究奖的部分支持。这项研究没有得到公共，商业或非营利部门的任何资助机构的特别资助。

参考

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