材料和试剂

½CC低剂量U-100胰岛素注射器28 G½（BD，目录号：329461）
1.5 ml微量离心管（SARSTEDT，目录号：72.690.301）
LepRb-Cre 小鼠
注意：
1. 由密歇根大学Martin Myers，Jr.博士友好提供的原始育种家培育的内部品种（乐山等，2006）;在POA（对照组，3个月大，3名男性和2名女性，n = 5）中注射AAV5-hSyn-DIO-mCherry（载体核心，北卡罗来纳大学教堂山分校）。 br />
2. 在POA（试验组，3个月）内注射AAV5-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry（Vector Core，University of North Carolina at Chapel Hill，由Bryan Roth博士友情提供）的LepRb- 3岁男性，2女性，n = 5）。
3. 所有实验均得到了Pennington生物医学研究中心的动物管理和使用委员会的批准。
CNO（Sigma-Aldrich，目录号：C0832）
盐水/ 0.9％NaCl（B.Braun Medical，目录号：L8001）
CNO股票（见食谱）
CNO工作解决方案（见食谱）

设备

PhenoMaster（TSE系统）
量表（Ohaus，Scout-Pro，型号：SPE601）
涡旋混合器（美国科学产品，目录号：S8223-1）

软件

LabMaster V5.0.8（TSE系统）
Excel 2010（微软）
SPSS 22（IBM）

程序

设置PhenoMaster TSE系统
1. 测量将用于实验的每只小鼠的体重。
  注：小鼠年龄匹配以消除年龄对能量消耗和食物摄入的混杂效应，并使小鼠之间的体重差异最小化。在实验开始时，小鼠体重介于20克和30克之间。使用体重相似的小鼠来减少数据分析过程中的误差，这一点很重要，因为当体重用于正常化能量消耗和食物摄入时。
2. 根据制造商的手册打开LabMaster并校准O 2和CO 2的气体传感器和食品和水的重量标尺。
  在校准之前不需要打开系统。
3. 打开气候室并将温度设置在23°C（图1）。
  
  图1. PhenoMaster TSE系统一个气候箱可以包含6个盒子，可以测量O 2，CO 2，食物摄入量，耗水量。
4. 将小鼠转移到住房箱（1只鼠标/箱;图2），并使用每个笼2个闩锁（一个前部和一个后部;图2）牢固地密封盖子。
  
  图2. PhenoMaster TSE系统的鼠标收纳盒每个盒子都配有进出气管，水和食物重量传感器，以及用于运动活动的红外光束框。 br />
5. 用自来水和普通食物的料斗填充水瓶，并将其悬挂在相应的重量传感器上。检查每个水瓶和食物料斗以分别获得良好的水流量和食物颗粒的可接近性是很重要的。
6. 在LabMaster的'设置'选项卡下，输入动物ID，体重，并设置其他参数，如测量间隔。在我们的实验中，测量间隔为25分钟。
7. 在“测量”标签下，选择“开始”开始测量。
每日注射和体重测量
注意：
1. 房间有一个12:12的光：黑暗循环，早上7点亮，晚上7点关闭。
2. 每当打开一个盒子来测量体重，补充水或食物或进行注射时，在系统测量特定盒子时防止外部空气进入盒子是非常重要的。系统刚刚完成对盒子的测量后，打开盒子的盖子是最安全的。选择'状态＆gt; LabMaster中的Calo'来识别系统正在测量的盒子。
3. 在打开框之前，请选择'状态＆gt;在LabMaster中试用监控饮料/喂料“来打开箱子监控屏幕（图3）。右键单击盒号下方的绿色圆圈，然后选择“暂停盒”暂时暂停该盒的测量（图3）。圆圈变成黄色。一旦箱盖重新打开并密封，右击同一圆圈并选择“继续箱子”重新开始测量（图4）。
4. 实验过程中每隔一周进行一次，将脏兮兮的鼠标盒底部更换为干净的底部，并用淡水重新装满水瓶。
5. 发生事故时，例如在系统正在读取同一个盒子时打开盒子，该盒子的该时间点的数据不应该用于以后的分析。
图3. Trial Monitor Drink / Feed屏幕的示例图像框编号下方的绿色圆圈表示用于测量的框。在这个例子中，框＃12和＃24不包含在实验中。

图4.示例图像显示了如何继续测量暂时停止的框
1. 整体实验方案请参见图5.
  
  图5.总体实验方案小鼠首先适应新的环境，然后注射3天的生理盐水，然后注射6天的CNO。每天早晨测量体重。
2. 第1-3天：让小鼠适应新环境，除了补充水分或食物外，没有任何干扰。在此期间，如果水渗漏并淹没床上用品，请更换有故障的部件（例如，吸管或整个瓶子）和箱子底部。
3. 第4-15天：每天早上9点测量每只小鼠的体重。
4. 第4-6天：每天两次在上午9:30和下午6:00对每只小鼠进行盐水IP注射。根据当天体重测定生理盐水注射量，以使其与体重达到0.3mg / kg剂量所需的CNO工作溶液量（0.06mg / ml）相匹配。例如，20克小鼠接受100μl盐水。
5. 第7-12天：CNO IP注射（0.3mg / kg），每天两次，上午9:30和下午6点，每只小鼠。如上所述，CNO注射量由当天的体重决定。
6. 第13-15天：小鼠从每日注射中恢复（不注射）。
完成实验并检索数据
1. 在早晨体重测量后的第14天，通过选择'测量>停止“在LabMaster中。
2. 把老鼠拿出来，用水和食物把它们放在正规的笼子里。
3. 要导出数据，首先进入'查看'选择参数和框号以导出数据。
4. 选择“导出＆gt;表'，然后指定文件名和位置。

数据分析

在Microsoft Excel中打开导出的文件（图6A）。
将能量消耗（H（1）以千卡/小时/千克为单位）和食物摄入量（以千克为单位）数据复制到新标签或文件中。
在Excel中为每日体重制作一张桌子（图6B）。

图6.用于数据分析的示例表 A.由LabMaster导出的能源消耗数据表的一部分。 B.体重表显示了所有小鼠的每日体重，群体平均值和实验过程中标准误差。
根据组划分数据并计算每组中所有时间点的均值和标准误差。
对于体重分析，根据第一个CNO注射日的体重计算每一天的体重变化。
对于能量消耗和食物摄入量分析，分别计算盐水注射（3天），CNO注射（6天）和恢复（2天）（图7）的每日平均值（千卡/克/天）。
通过SPSS中的重复测量ANOVA（方差分析）进行统计分析。通过Bonferroni方法校正了多对配对比较。

图7.日常食物摄入量分析表每种食物摄入量均为每种治疗情况的平均值，并对组别平均值进行比较。

笔记

使用纯合的LepRb-Cre小鼠来最大化Cre表达以获得更有效的病毒基因表达。

食谱

CNO库存（5毫克/毫升）
1. 加入1毫升生理盐水至5毫克CNO粉末
2. 漩涡直到粉末完全溶解
3. 转移到1.5毫升微量离心管中，并保持在4°C
注：库存CNO在4°C下至少稳定6个月。但是，CNO可能会随着时间推移而沉淀。加入少量的DMSO（3-10％）可能有助于溶解CNO并防止沉淀。
CNO工作溶液（0.06mg / ml）
1. 取出并平衡CNO储备溶液至室温
2. 涡旋混合并溶解任何可能的CNO颗粒
3. 用盐水稀释CNO储液83.3倍以达到0.06mg / ml的终浓度。例如，要制造1 ml工作溶液，将83μlCNO储液加入917μl生理盐水中
4. 在注射当天使其保持新鲜状态，并将其作为室温溶液使用，而不会升温至体温范围内

致谢

这项工作得到AHA053298N，P / F DK020572-30，R01DK092587（HM），P20GM103528（HM和SY）和2P30-DK072476（HM和SY）的支持。部分支持通过由NIDDK NORC中心Grant P30 DK072476资助的动物表型鉴定核心提供。作者声明没有竞争的财务利益。该协议是根据Yu等人发表的程序改编的。

参考

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