材料和试剂

银线（世界精密仪器公司，产品目录号：AGW2030）
1ml注射器（CHEMIL s.r.l.，Padova，目录号：S01G25）
培养皿35毫米（任何生产者都很好）
用Sylgard（Dow Corning，Sylgard 184 Silicone Elastomer试剂盒）涂覆的培养皿（35×10mm）
柔性针电极Microfil（世界精密仪器公司，产品目录号：MF34G-5）
2μl微量吸管的技巧
200μl微量吸管的技巧
1,000μl微量吸管的技巧
用于细胞内微电极的玻璃毛细管（长度100mm，内径0.86mm，外径1.50mm; Science Products，目录号：GB150F-10）
用于刺激微电极的玻璃毛细管（长度100mm，内径1.05mm，外径1.50mm; Science Products，目录号：GB150TF-10）
希望的应变和年龄的小鼠
注：我们在此使用plp-GFP C57BL / 6J转基因小鼠。
氯化铁（III）（FeCl 3）（Sigma-Aldrich，目录号：451649）
氯化银（AgCl）（Sigma-Aldrich，目录号：204382）
μ-芋螺毒素GIIIB（Alomone，耶路撒冷，以色列）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
氯化镁，标准溶液1M（MgCl 2）（Honeywell International，Fluka，目录号：63020）
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C5080）
氯化氢（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：H1758）
乙酸钾（CH 3 COOK）（Sigma-Aldrich，目录号：P3542）
林格的解决方案（见食谱）
记录电极溶液（见食谱）

设备

微量移液器
容量瓶（通常500毫升;任何生产者都可以）
电生理学设置完成与防震台（纽波特，美国）（图3）
用于电生理学设置的立体显微镜（Leica Microsystem，型号：Leica MZ125，数值孔径0.8，计划消色差物镜1.6x）（图3中＃1）
用于细胞内记录电极的液压显微操作器（NARISHIGE，型号：MHW-103，三轴水力显微操作器）（图3中的＃2）
刺激电极显微操作器（手动显微操作器，MärZHÄUSERWETZLAR，型号：MM 33）（图3中＃3）
法拉第笼（图3中＃4，自制）和刺激器：S88刺激器（Grass，Warwick，RI，USA）（图3中＃5）
放大器：细胞内桥式放大器（Npi electronic，型号：BA-01X）（图3中＃6）
2镊子（微珠宝镊子，鲁道夫医学，目录号：RU 4240-05）
剪刀（微弹簧剪刀，Rudolf Medical，VANNAS，目录号：RU 2260-08）
剪刀（精致手术剪刀，Rudolf Medical，目录号：RU 1503-12）
解剖显微镜（OPTIKA显微镜，型号：SZM-LED2）
移液器拔管器（P-97火焰/布朗微管拔管器）（Sutter Instruments，型号：P-97）
A / D接口（National Instruments，型号：PCI-6221）和与该软件兼容的计算机（图3中的＃7）
气罐95％O 2与5％CO 2（任何尺寸和任何供应商都很好）
气缸压力调节器（Air Liquid，型号：HBS 240-1-2）

软件

录音：WinEDR免费软件（斯特拉斯克莱德大学，格拉斯哥，苏格兰，英国）
分析：Clampfit（Molecular Devices，Sunny-vale，CA，USA）

程序

解决方案和设置准备
1. 使用移液管拉拔器从丝状硼硅酸盐玻璃（外径：1.5mm;内径0.86mm）和用于丝状硼硅酸盐玻璃（外径：1.5mm;内径1.05mm）的用于神经刺激的微电极拉出用于细胞内记录的微电极。许多电极可以拉出并储存在室温下直到使用。
  注意：拉细胞内或刺激微电极的准确设置可能因玻璃（硼硅酸盐和硅铝酸盐），玻璃毛细管壁的厚度，玻璃毛细管制造商和批次，拉片加热片尺寸，材料和时间，拉伸速度，时间，步骤，每个步骤的热量以及环境条件（湿度）。这些参数与细胞内微电极特别相关，必须准确设置，直到电极电阻达到最佳（见下文）。这需要在加热条件下仔细了解玻璃微电极的行为，并且在设置调整到新值时清楚了解拉拔器功能和响应。建议用不同的牵引器设置牵拉多个毛细血管，直到确定正确的参数。电阻可以通过利用特定的胞内放大器电路来测量，该电路根据欧姆定律显示测量的电阻。一个理想的电阻应该在10到30MΩ之间，这个值基本上对应于非常小的尖端，直径为0.5微米（见图2）。刺激电极的尖端尺寸并不重要，因为它可以通过朝着记录室底部的温和触碰将其断开来调节至神经直径（见图2A）。
2. 通过用95％O 2，5％CO 2鼓泡至少15分钟将林格溶液（配方1）缓冲至pH 7.4。
  注意：一次标准实验需要约10 ml的溶液。
3. 准备氯化银线。 AgCl的形成通过在10mM FeCl 3 / HCl溶液中化学氧化Ag涂覆的电极来实现。将电极浸入溶液10秒。
  注意：由于反复插入玻璃微电极会刮擦AgCl层，因此应定期重复此步骤（大约每2-3周）。
4. 用记录电极溶液回填记录电极（配方2）。该步骤以两个连续的步骤进行：
  1. 通过加热（中等长度）用点火器预热电极几秒钟，并快速将底部浸入溶液中。使预填充电极保持水平，以使溶液通过毛细管现象向上流至尖端（图2B）。这大约需要30分钟;
  2. 使用1毫升注射器和电极Microfil毛细管，添加记录电极溶液，直到电极几乎被填充（见图2C）。
    注意：避免在电极填充过程中注入气泡。
    
    图2.刺激和记录电极A.刺激电极。预填充（B）和填充（C）记录电极。箭头表示解决方案填充的级别。
5. 打开电生理设备的组件（图3）。
  
  图3.电生理设置组件。 1）立体显微镜专用于电生理学建立; 2）细胞内电极显微操作器; 3）刺激电极显微操作器; 4）法拉第笼; 5）刺激器; 6）放大器;和7）带有WinEDR免费软件的电脑。
6. 连接录音（填充）和刺激电极到他们的电极持有人。在显微镜下放置装满林格溶液的培养皿，并将记录电极尖浸入溶液中。打开放大器并测试电阻。最佳值在10到30MΩ之间。
  备注：
  1. 电极电阻与尖端直径成正比（尖端越大，电阻越低）。这种关系可能会由于实验问题而改变：i）由于盐微晶体的形成或微气泡的存在，尖端的不完全填充或阻塞倾向于增加电阻。要恢复合适的值，将电极尖端浸入林格溶液中几分钟：盐溶解并且电阻降低。如果不是，轻轻地揉搓电极室底部的电极尖端，以对尖端造成'受控制的损伤'。阻力应该下降。
  2. 微电极电阻的突然增加通常是由于组织碎片（结缔组织或脂肪组织）引起的尖端阻塞。在这种情况下，可以通过传递大量正电流或负电流来清洁吸头（许多放大器具有“电极吸尘器功能”）。或者，将尖端与腔室底部摩擦也可能有所帮助。如果电阻不降低和/或记录迹线有噪音，则必须更换电极。当电阻低于10MΩ或尖端太宽（已损坏）时，电极也必须更换。
7. 打开刺激器并设置刺激参数：对于eEPP，0.4毫秒持续时间和0.5 Hz频率的刺激是适合的。
  注意：这些参数必须进行优化以测量NMJ功能，原因有两个：a）脉冲步长持续时间最短以防止过度的刺激伪影; b）脉冲步频非常低，以防NMJ“疲劳”。
8. 运行WinEDR免费软件。
解剖比目鱼肌
1. 根据你的动物处理协议安乐死鼠标。
  注意：所有程序均按照意大利法律和政策（DL No. 26，2014年3月14日）执行，欧盟委员会指令2010/63 / UE并经帕多瓦大学（OPBA-Organismo Preposto al Benessere degli Animali）的兽医服务批准（第359/2015号议定书）。所有的程序应该根据进行实验的机构的道德标准来使用。
2. 用剪刀在脚踝周围切割皮肤。
  在大腿上切下鼠标腹部（图4A）。
3. 借助镊子，皮肤后肢肌肉。把鼠标放回仰卧位，并用针脚挡住爪子。使用小剪刀，切开跟腱（图4B）。
4. 轻轻地拉动肌腱，用Vannas剪刀，通过切除比目鱼肌外侧的结缔组织（图4C），伴随肌肉从腓骨脱离。
  注意：
  1. mEPP和eEPP的电生理学记录可以在任何可收集的肌肉中实际上完成，而不损伤肌纤维并且其神经正确附着。在这里，我们提供比目鱼肌肉的详细程序，在我们看来，这是最容易收获的比目鱼肌肉。
  2. 将结缔组织从内侧切到外侧以避免（比目鱼）肌肉受损。
  图4.比目鱼肌收集的初始步骤。：一种。切割皮肤在脚踝和大腿周围; B.切开跟腱; C.箭头显示切割方向以分离结缔组织避免肌肉损伤。
5. 当整个比目鱼肌肉可见时，使用小Vannas剪刀仔细切断第二根肌腱尽可能靠近膝盖（图5A）。此时，比目鱼肌对跟腱退缩，肌肉附着的肌肉都可以切除而不影响比目鱼肌的完整性（图5B）。
6. 将肌肉置于Sylgard底部的培养皿中，并充满氧化林格溶液。如图5C所示将它们固定，使比目鱼肌朝向操作员（黑色箭头）。将培养皿置于立体显微镜下进行下一步操作。
  注意：对于解剖，Ca 2 +游离Ringer's溶液对于防止由于机械刺激引起的肌肉收缩或挛缩是可取的。
  
  图5.收集下肢后肢肌肉箭头表示比目鱼肌。
7. 使用镊子，通过抓住下部肌腱轻轻抬起比目鱼肌，并切割连接组织使其与腓肠肌连接。继续直至神经可见（图6A）。神经位于比目鱼的下面，看起来像插入肌纤维的白线（图6A-6C中的虚线）。
8. 使用Vannas剪刀清理结缔组织的神经（图6B）。
  注意：最佳刺激需要大约0.5厘米的神经长度。
9. 当比目鱼肌及其神经完全自由时，切开跟腱水平的腓肠肌（图6C）。
  
  图6.比目鱼的神经分离和解剖仍然是相关的。虚线表示神经; S是比目鱼肌，G是腓肠肌。
10. 通过两根肌腱将比目鱼肌固定在培养皿底部（图7A）。
  注意：必须固定比目鱼肌以拉伸肌肉并促进记录电极进入肌纤维。避免过度拉伸，这可能会导致肌肉纤维受损。
  
  图7.实验室的细节A.肌肉定位到培养皿中; B. 1）记录电极; 2）刺激电极; 3）地面; 4）充氧管; 5）参比电极; 6）比目鱼肌。
11. 轻轻地，从残余组织碎片中清除肌肉和神经，而不会损伤纤维或神经。
12. 用林格溶液冲洗肌肉一至两次，以消除结缔组织碎屑或皮毛。将肌肉留在装满2毫升新鲜林格溶液的培养皿中。
神经刺激和EPP记录
1. 将培养皿放置在电生理学设备的立体显微镜下，并浸没连接到O 2 / CO 2气罐的管以使氧气在溶液中起泡（图7B）。
2. 将地面和刺激电极的参考放在溶液中（图7B）。注意：需要接地以消除由于法拉第笼内部设备之间的电流回路而产生的电气噪声（法拉第笼需要防止电网电流噪声）。需要参考来测量肌纤维膜两端的电压，即静息电位以及它如何变化（mEPP，eEPP和动作电位）。通过比较记录电极的电压和参考物的电压来测量膜电位，所述参考物必须与肌肉周围的细胞外液（溶液）接触。
3. 使用显微操作器，将刺激电极置于溶液中并吸取林格溶液（填充大约一半的电极体积）。然后，将电极靠近神经残端并将其与溶液一起吸入电极（图8）。
  注意：使用注射器产生负压以抽吸溶液并吸入神经。必须将神经完全浸入溶液中以避免空气进入电极并提供电极与神经之间的电连续性。
  
  图8.电极的定位A.记录电极1）比目鱼肌2）记录电极3）神经。 B.刺激电极。 1）比目鱼肌，2）记录电极，3）神经和4）记录电极。
4. 通过增加电压强度刺激神经，直到肌肉收缩。对于细胞内记录，将刺激器设置为实现肌肉收缩所需值的1.5倍的电压强度。
  注意：肌肉收缩通常是在5到10V之间的电压下实现的。如果15V内没有达到收缩，神经可以被推出并再次吸入电极。或者，更换销钉以减少肌肉拉伸。如果收缩仍不可见，可能是在解剖过程中神经受伤。避免电压高于20 V，因为肌肉收缩可能是由肌肉直接刺激触发的。
5. 通过使用细胞内电极显微操作器，将记录电极的尖端放入腔室的林格溶液中并打开放大器。将电压偏移到0.将电极尖端移动到图9所示盒装区域内的肌肉纤维附近，其中神经进入肌肉并且NMJ集中。当电极的尖端接近肌纤维时，观察到电压的轻微极化（约-20mV）。
  注意：尽管不是绝对必要的，但运用荧光报告基因的转基因小鼠在运动神经元或Schwann细胞中偶联荧光立体显微镜有助于更准确地发现NMJ。
  
  图9. NMJ的分布启动子（plp-GFP（Mallon等人，2002））下在Schwann细胞中表达GFP的C57 / BL6 / J转基因小鼠的比目鱼肌，用落射荧光立体显微镜成像。使用荧光施万细胞，NMJ可以很容易地在神经轴突末端（白色圆圈）被发现。
6. 用显微操作器将记录电极向肌肉深处移动。当肌纤维正确穿刺时，从放大器或示波器/计算机接口读取的电压突然下降到非常负的值，对应于肌纤维的静息电位（V rest）一般在-90到-60mV之间）。
  注意：
  1. V Rest 的值因细胞而异，在某些情况下则因治疗而异。在这种情况下，记录来自骨骼肌细胞，其中V rest在-60和-90 mV之间。为了获得可比较的eEPP幅度（eEPP幅度线性地依赖于V rest（Boyd和Martin，1955）），V rest被任意设定为-70mV以通过使用电流来标准化注射命令。
  2. V Rest 是NEGATIVE。正电位可能对应于光纤外部电极的错位。
  3. 如果静息电位在-20和-40 mV之间，电极没有正确插入肌肉细胞。放大器通常配备'BUZZ功能'，这是一种基于过补偿电容补偿系统引起的振荡的电路，有助于电极进入光纤。
  4. 如果膜电位逐渐去极化（即，缓慢返回到0），肌纤维膜可能被损坏并泄漏或电极脱落。改变纤维。
  5. 在任何情况下，损坏的纤维都不会显示预期的膜电位，从而改变纤维。
  6. 延长去神经支配，如用肉毒杆菌神经毒素或神经切断治疗的情况下，增加静息膜电位。常见的结果是肌纤维颤动，肌纤维的自发性，随机性和异步性收缩（Purves和Sakmann，1974; Moravec和Vyskocil，2005）。原纤维化可被特定药物抑制（见下文）。
7. 此时，可以记录mEPP。
  1 ：在刺激时，动作电位被激发并且可以被记录。相反，eEPP不能被记录，因为它们被动作电位隐藏/覆盖。
  2 ：请考虑动作电位会导致肌肉收缩，这可能会破坏记录电极或导致其从光纤中退出录制。
8. 添加μ-芋螺毒素GIIIB以选择性地抑制负责触发突触后动作电位的电压门控Na + +通道（Nav1.4主要由肌肉表达），从而停止肌肉收缩。使用微量移液器，向培养皿中加入1μlμ-芋螺毒素原液（1 mM），并开启氧合。
9. 15分钟后，刺激并检查肌肉收缩。如果肌肉没有收缩，可以记录EPP，否则再等5-10分钟。
  注意：更深的肌肉纤维可能需要更多时间用于μ-芋螺毒素活性。
10. 停止氧合作用（由于起泡或过度流动引起的溶液运动将人为因素引入记录）并开始刺激。
  注意：eEPP幅度与神经递质释放量成正比，而释放量又与刺激后释放的突触囊泡的数量成正比。因此可以使用eEPP来测试神经末梢的功能状态，从而提供对突触前效应的准确估计。
11. 设置记录时间（至少30秒）并记录电流钳模式下的eEPP。对每个肌肉打十几根纤维重复该过程（如果eEPP在同一肌肉内是异质的，则增加纤维采样）。典型的记录轨迹如图10所示，其中刺激伪影（与刺激幅度成比例），EPP与神经末端活性和mEPPs成正比。
  
  图10.采集期间的典型痕迹

数据分析

WinEDR软件提供EDR文件格式。使用WinEDR软件，将该文件导出为与Clampfit软件兼容的ABF文件格式。
注意：数据分析的步骤可能因用于记录和分析的软件而异。
用Clampfit软件打开ABF文件并在控制轨迹上建立一个模板。在控制轨迹中定义eEPP的形状将'教导'Clampfit软件在所有其他文件中自动识别eEPP（或mEPP）的形状。分析所有要与同一模板进行比较的分析文件。 Clampfit软件为跟踪中的每个事件提供一个表格，其中定义了EPP格式的参数（开始时间，结束时间，峰值幅度，面积等等。）。
注：EPP的一般形状是抛物线。初始斜率与发射器的突触后响应的平均幅度有关（突触后效应）;曲率的程度与递质释放的可能性（突触前功效）有关;该幅度与突触前终端中独立突触前释放位点的数目有关。通常，eEPP和mEPP幅度之间的比率被计算为eEPP的“量子含量”，即在突触前动作电位之后发生融合的囊泡的数量。理论上，不同实验条件下的不同曲线的视觉比较提供了关于哪些突触参数被改变的见解。

食谱

林格的解决方案

注意：
1. 使用ddH 2 O。所有使用的玻璃器皿必须用0.1M氯化氢洗涤以除去任何痕量的碳酸盐，并冲洗得很好。一旦准备好，这种解决方案可以储存在4°C，但不超过3个月。如果存在沉淀物或乳光，则丢弃并制备新的溶液。
2. 在分析之前，林格溶液用95％O 2，5％CO 2，5％通过曝气至少15分钟以获得7.4的pH水平。
记录电极解决方案

致谢

这项工作得到了帕多瓦大学的支持，授予M. Pirazzini授予“未在帕多瓦大学就业的年轻人的高级研究资助”，并向S. Negro授予“初级奖学金”，Fondazione Caritro授予'Bando 2017 giovani ricercatori coinvolti in progetti di eccellenza'授予G. Zanetti。所有程序均在由生物医学科学系（帕多瓦大学）Cesare Montecucco教授领导的'神经毒素，神经麻痹和再生'实验室中进行。作者声明没有竞争利益。 SN和GZ在AM的帮助下进行比目鱼肌肉制备的程序。 SN和GZ拍照描述所有的程序并准备好数字。 GZ和MP在SN的帮助下写了这篇论文。所有作者都回顾了手稿并批准了最终版本。

参考

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