材料和试剂

低保留移液器吸头（Fisher Scientific，产品目录号：02-717-134,02-717-143,02-707-511）
预润滑的微量离心管（Corning，Costar ，产品目录号：3206,3207）
96孔黑色底壁，底部清澈，无结合，无菌，Greiner Bio-One微量滴定板（Greiner Bio One International，目录号：655906）
Tricorn XK 16/40 SEC柱（GE Healthcare，目录号：28988938）
带有RNA Mango标签RNA的细菌细胞（大肠杆菌）。
液氮
TO1-PEG3-Desthiobiotin（ABM，目录号：G956）
高容量链霉亲和素琼脂糖珠（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：20357）
Superdex 200树脂（GE Healthcare，目录号：17104301）
SYBR Green II RNA凝胶染色剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：S7564）
19：1丙烯酰胺：Bis 40％（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9022）
N，N，N'，N' - 四甲基乙二胺（TEMED）（Sigma-Aldrich，目录号：T9281）
过硫酸铵（APS）（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610700）
硼酸（ACP Chemicals，目录号：B2940）
EDTA（ACP Chemicals，目录号：E4320）
Tris碱（Fisher Scientific，目录号：BP152）
Tris-HCl（Sigma-Aldrich，Roche Diagnostics，目录号：10812846001）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
DTT（Sigma-Aldrich，Roche Diagnostics，目录号：10197777001）
氢氧化钠（NaOH）（VWR，BDH，目录号：BDH9292）
氯化钠（NaCl）（ACP化学品，目录号：S2830）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
肝素（Sigma-Aldrich，目录号：H0777-25KU）
生物素（Sigma-Aldrich，目录号：B4501）
酵母提取物（Fisher Scientific，目录号：BP1422）
胰蛋白胨（Fisher Scientific，目录号：BP1421）
氢氧化钾（KOH）（VWR，BDH，目录号：BDH9262）
10x细菌天然提取物（ BNE ）缓冲液（见食谱）
10倍缓冲 A （见食谱）
10x HEPES KCl（ HK ）缓冲液（见食谱）
10x 绑定缓冲区（请参阅食谱）
10x生物素洗脱缓冲液（见食谱）
LB 媒体（请参阅食谱）

设备

标准的个人防护设备
移液器
蠕动泵
馏分收集器和适当的收集管
SpectraMax M5荧光读板器（Molecular Devices，型号：SpectraMax M5）
温控室（保持在4°C）
制备离心机，微量离心机和台式Picofuge
用于1.5毫升管的管旋转器
聚丙烯酰胺凝胶运行设备
法国媒体
Sorvall RC6 +离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Sorvall TM RC 6 Plus）
Sorvall SLA-1500转子（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：SLA-1500）
NanoDrop
高压灭菌器

程序

构建设计
1. RNA Mango的单个拷贝通常足以用于下拉分析，并且可以插入到既不存在干扰感兴趣的RNA功能的预先存在的茎环中（图2 （Panchapakesan
  
  图2.生物相容性芒果-I标签的设计A.使用Leontis-Westhof命名法（Leontis和Westhof，2001）描述了一般的GNRA四环结构。 B.芒果I的结构（由Autour等人修改的图（<2018年）>）。通过用感兴趣的RNA的茎序列代替紫色突出的N-N'茎，可以将芒果掺入到自然发生的茎环结构中。在芒果I中，GAAA四环状基序（蓝色）通过侧翼包围核心G-四链体（3层：T1，T2，T3），使得芒果I核适合GAA / A，其中'/'是芒果核心插入点。因此，只要芒果不干扰四环素的生物功能，芒果I可以以类似的方式插入预先存在的GNRA四环结构中。
2. 芒果标记的RNA应该针对芒果标签的功能以及感兴趣的RNA进行测试。芒果标签的功能可以通过测量感兴趣的芒果标签RNA的荧光并将其与体外转录的RNA芒果（Panchapakesan 等<2017 ）。通常，在1x结合缓冲液中制备1μMRNA溶液以及2倍过量的TO1-Dtb配体。在室温下孵育5分钟后，可以使用荧光计进行荧光测定。对于SpectraMax M5荧光计，以下激发和发射设置对于分析RNA芒果介导的荧光是最佳的：在495nm激发;发射535纳米PMT：中等，截止515纳米 - 底部读取。在上述设置下使用SpectraMax M5，可以可靠地检测低至5 nM的RNA芒果浓度。用户应优化激发和发射波长，以尽量减少所用特定荧光计激发光源的干扰。＆nbsp;
天然提取物制备
1. 具有RNA Mango标记的感兴趣的RNA的细菌细胞（大肠杆菌）应该在适当的生长条件下生长以最大限度地形成所需的RNP复合物。我们通常在1L LB培养基中过夜培养细胞。
2. 然后使用Sorvall SLA-1500转子，在冷冻Sorvall RC6 +离心机中将细胞在3800×gg（RCF）下沉淀10分钟。然后将得到的细胞沉淀物重新悬浮在20ml预先冰冻的BNE缓冲液中。通过在1000 psi下两次通过4°C法式压力机传代裂解细胞。如果法国报刊不可用，那么可以使用替代细胞破碎技术，如超声处理或酶法如溶菌酶消化。然后通过在13,200×g（RCF）下在4℃下离心10分钟来澄清该粗裂解物。澄清的裂解物在液氮中快速冷冻并储存在-80℃直到准备使用。对于其他生物体，包括酵母，应使用适当的天然提取物制备方案。
3. 由于与TO1-Desthiobiotin的结合需要KCl（Dolgosheina等人，2014; Jeng等人，2016; Panchapakesan 等，2017）。
  在步骤B2和B3中处理所有材料
TO1-Desthiobiotin链霉亲和素琼脂糖珠粒制备
准备适量的链霉亲和素琼脂糖珠浆液。使用7ml细菌提取物和700μl链霉亲和素琼脂糖珠浆液，用42纳摩尔的TO1-Desthiobiotin进行衍生化，我们在过表达6S调节RNA时获得了高质量的结果（Dolgosheina等人，2014; Panchapakesan 等人，2017）。根据实验条件缩放下面的协议。
1. 小心地重新悬浮链霉亲和素琼脂糖珠浆
2. 在1.5 ml Eppendorf管中吸取700μl链霉亲和素琼脂糖珠
3. 使用标准实验室旋转器在室温（RT）下用1ml缓冲液A（每次2分钟）洗涤两次。可以在Picofuge中简单离心管以从珠中除去多余的液体。
4. 使用1ml HK缓冲液洗涤珠3次，每次洗涤2分钟，再次使用旋转器。
5. 对于每100μl链霉亲和素琼脂糖珠，在100μlHK缓冲液中与6纳摩尔TO1-Desthiobiotin孵育。在RT上在旋转器上孵育15分钟。注意前和后的荧光团溶液的OD 500（λ500 = 63,000M -1 -1 cm -1）在与珠粒结合后使用NanoDrop估计结合的荧光团的量。 TO1-Desthiobiotin的90％以上应该受到约束。由于荧光团结合，珠子的颜色现在变成橙色。不同的珠子可能具有不同的结合能力，如果需要，应该凭经验确定。
6. 用1ml的 HK 缓冲液清洗残余的未结合的荧光团。
提取物与制备的琼脂糖珠的结合
由于该过程的最终目标是在天然条件下纯化RNP复合物，所以应注意不要在纯化的每个步骤中变性复合物，即珠结合，洗涤和洗脱。由于RNA Mango需要KCl以正确折叠并与TO1-目标生物素配体结合（Dolgosheina等人，2014; Jeng等人，2016; Trachman III等人， et al。，2017），KCl应包括在所有结合，洗涤和洗脱步骤中。缓冲区的其他组件可以根据实验需要进行修改。
1. 在RT下将7ml细菌提取物结合到珠上。在RT上孵育15分钟（在酵母提取物的情况下（Panchapakesan等人，2017），在4℃下进行结合以确保RNP复合物的稳定）。如果需要，可以通过向提取物中加入 BNE 或结合缓冲液来稀释提取物。
2. 用1ml强结合缓冲液洗涤两次，每次循环2分钟。选择的洗涤次数取决于预期的RNP综合体的稳定性。同样，如果需要优化，每次洗涤的温度（4-37°C）和时间（2-15分钟）都可以进行显着调整。
生物素介导的本地洗脱
在旋转器上使用20mM生物素洗脱缓冲液以500μl体积在37℃洗脱（Panchapakesan等人，2017）20分钟，因为生物素有效地从链霉抗生物素蛋白中取代脱硫生物素（Hirsch et al。，2002）。在生物素介导的天然洗脱之后立即进行下游加工是合乎需要的。如果不是，则应将样品分装并立即在液氮中快速冷冻备用。
下游处理：微量滴定板荧光测定和凝胶染色测定
1. 将200μl生物素洗脱液加载到96孔黑色壁上，清除底部微量滴定板并测量荧光发射。
2. 为了估计芒果下拉的RNA部分的纯度，表达水平和完整性，苯酚氯仿提取20μl生物素洗脱液以及等量的输入，流过并洗涤。如其他地方所述用TBE进行变性5％PAGE。如果RNA的表达良好，SYBR染色可以用来显示感兴趣的RNA和判断RNA污染水平。如果RNA表达水平低，Northern印迹可以用来判断RNA的完整性和表达水平。
链霉亲和素纯化的芒果复合物的尺寸排阻色谱（SEC）
由于生物素洗脱的RNP复合物是高度荧光的（虽然它与TO1-Desthiobiotin结合），但它可以用二次纯化技术如SEC进一步纯化（Panchapakesan等人，2017）。对于SEC纯化，加载到含有SEC树脂的大小排阻柱上，所述SEC树脂适合被纯化的RNP复合物的预期分子大小。为了纯化与细菌RNAP复合的芒果标记的6S RNA，我们使用Superdex 200柱（24ml，16mm直径），使用0.1ml / min流速的HK缓冲液。在这个例子中，380微升生物素提取物被加载到色谱柱上。该柱在4℃下运行，500μl级分收集在硅烷化塑料管中。
1. 馏分分析：将来自各馏分的200μl置于96孔黑色壁，透明底部微量滴定板中，并使用SpectraMax M5荧光板读数仪（如前所述设定）测量荧光。请注意，RNA芒果荧光是温度敏感的，在较低温度下获得最大荧光（Jeng et al。，2016）。因此，如果RT下的信噪比较低，则原则上可以通过在4°C下测量荧光来改善信号，前提是可以避免冷凝。
2. 汇集感兴趣的荧光部分。可以使用多种技术如质谱分析，蛋白质印迹等来分析纯化的RNP复合物。我们使用了不列颠哥伦比亚大学蛋白质组学核心设施，使用LC-MS / MS分析样品，经SDS PAGE凝胶纯化后成功。

数据分析

对于更多的数据分析，如变性凝胶（步骤F2），纯化的RNP复合物的SEC迹线（步骤G1），读者可参考（Dolgosheina等人，2014; Panchapakesan等人，2017）。

笔记

KCl对于RNA Mango适体与TO1-Desthiobiotin结合是必不可少的，但这种结合仅适度依赖于KCl浓度（Dolgosheina等人，2014），可根据需要进行调整（90-150 mM终浓度）。然而，随后几代芒果（芒果II，III和IV）在最佳KCl浓度范围内（5-150 mM，Mango III在20 mM KCl下最佳起作用）灵活得多，并且功能性高达至少256 mM MgCl _）。
我们在没有RNA酶和蛋白酶抑制剂的情况下进行纯化时已经取得了成功，但可以根据需要考虑将这些添加到缓冲液和缓冲液中。
尽管该方案广泛涉及从细菌细胞纯化，但它也可以用于与真核系统如酵母细胞一起工作。如果使用酵母细胞，应相应地改变诸如天然提取物制备（步骤B1），提取物与珠粒（步骤D）和洗脱（步骤E）的结合等步骤。

食谱

注意：缓冲液（准备为10倍无菌滤过的原液，储存在-20°C或更低）。

10x细菌天然提取物（ BNE ）缓冲液
200 mM Tris pH 8.0
900毫摩尔KCl
10mM MgCl 2 2/2 准备100 mM DTT储备液并在使用前组成1x BNE 缓冲液以包含1 mM新鲜DTT（最终）
10x缓冲区 A
1,000 mM NaOH
500 mM NaCl
10倍HEPES KCl（ HK ）缓冲液
150 mM HEPES pH 7.5
900毫摩尔KCl
10x 绑定缓冲区
150 mM HEPES pH 7.5
900毫摩尔KCl
750μg/ ml肝素*
在使用前立即加入1mM新鲜DTT（最终），从 HK 缓冲液中准备1x Binding 缓冲液。由于许多RNA结合蛋白带正电，肝素（带负电荷的硫酸化碳水化合物）可作为廉价竞争者加入，以抑制非特异性RNP复合物的形成。
10倍生物素洗脱缓冲液

缓冲液中含有200 mM生物素
LB 媒体
10克胰蛋白胨
5克酵母提取物
10克NaCl
使用前的高压灭菌器

致谢

PJU承认NSERC发现运营资助。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

Autour，A.，S。C.Y.J.，A，D.C.，Abdolahzadeh，A.，Galli，A.，Panchapakesan，S.S.S.，Rueda，D.，Ryckelynck，M.and Unrau，P.J。（2018）。荧光RNA芒果核酸适体用于哺乳动物细胞中非编码小RNA的成像 Nat Commun 9（1）：656.
Dolgosheina，E.V.，Jeng，S.C.，Panchapakesan，S.S.，Cojocaru，R.，Chen，P.S.，Wilson，P.D.，Hawkins，N.，Wiggins，P.A。和Unrau，P.J。（2014）。 RNA芒果适体 - 荧光团：一种用于RNA标记和跟踪的明亮，高亲和力复合物。 ACS Chem Biol 9（10）：2412-2420。
Hirsch，J.D.，Eslamizar，L.，Filanoski，B.J.，Malekzadeh，N.，Haugland，R.P.，Beechem，J.M。和Haugland，R.P。（2002）。易于逆转的脱硫生物素与链霉亲和素，抗生物素蛋白和其他生物素结合蛋白的结合：用于蛋白质标记，检测和隔离。 Anal Biochem 308（2）：343-357。
Jeng，S.C.，Chan，H.H.，Booy，E.P.，McKenna，S.A。和Unrau，P.J。（2016）。荧光配体结合和RNA Mango和RNA Spinach核酸适体的复杂稳定化 RNA 22（12）：1884-1892。
Leontis，N.B.和Westhof，E.（2001）。 RNA碱基对的几何命名和分类 RNA 7（4）：499-512。
Panchapakesan，S.S.S.，Ferguson，M.L.，Hayden，E.J.，Chen，X.，Hoskins，A.A。和Unrau，P.J。（2017）。使用RNA芒果进行核糖核蛋白纯化和表征 RNA 23 （10）：1592-1599。
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Trachman，R.J.，3rd，Demeshkina，N.A.，Lau，M.W.L.，Panchapakesan，S.S.S.，Jeng，S.C.Y.，Unrau，P.J。和Ferre-D'Amare，A.R。（2017）。 RNA芒果高亲和性荧光素结合和活化的结构基础 Nat Chem Biol 13（7）：807-813。