材料和试剂

生物材料
1. 拟南芥种子和幼苗（Ecotype Columbia，Col-0）
2. 内部生产的6xHis AtRALF1重组多肽＆nbsp;
用于种子灭菌和生长的化学品和材料
1. 方格培养皿，格栅100毫米宽×15毫米高，无菌（Electron Microscopy Sciences，目录号：70691）
2. 透明塑料包装
3. 量筒1000,100和10毫升（Uniglas）
4. 1,000μl过滤嘴（NEST Scientific，目录号：NPT1000-B-B）
5. 200μl过滤嘴（NEST Scientific，目录号：NPT0200-B-Y）
6. 10μl过滤嘴（NEST Scientific，目录号：301001）
7. 结冷胶粉（Culture Gel Gel TM I型 - 生物技术等级）（PhytoTechnology Laboratories，目录号：G434）
8. Murashige＆amp; Skoog Basal盐混合物（PhytoTechnology Laboratories，目录号：M524）
9. 无菌蒸馏水
10. 次氯酸钠溶液
11. 次氯酸钠（NaClO）溶液50％（v / v）（见食谱）
含有pH敏感指示剂溴甲酚紫的凝胶的化学品和材料
1. 量筒100毫升（Uniglas）
2. 培养皿150 x 20毫米无菌
3. 溴甲酚紫游离酸试剂级（C 2 H 16 Br 2 O 5 S，AMRESCO，目录号： 0531-25G）
4. 硫酸钙二水合物（CaSO 4·2H 2 O，Merck，目录号：102161）
5. 氢氧化钾（KOH）
6. 盐酸（HCl）
7. 琼脂糖RA（生物技术级，AMRESCO，目录号：N605-500G）
8. 无菌蒸馏水

设备

称重天平（RADWAG Wagi Elektroniczne，型号：AS 220 / C / 2）
磁力搅拌器（Fisher Scientific）
pH计（Thermo Orion，PerpHecT LongR计，型号：350）
移液器（Nichipet EX，P1000，P200，P10）
烧杯1,000毫升（PHOX，Boro 3.3）
烧杯250毫升（APRX，Boro 3.3）
高压灭菌器（Sercon，型号：HS 1-0101）
层流罩（Pachane，型号：PA 440）
生长室/受控环境室
埃伦迈耶（PIREX）
微波炉（BRASTEMP，目录号:: BMJ38ARANA）
镊子
数码相机（Cyber-shot，Sony，型号：DSC-H300）

程序

种子灭菌和发芽
为了分析根培养基碱化，将幼苗在含有半强度MS培养基（参见食谱）的平板上生长9天。
1. 使用1ml次氯酸钠溶液50％（v / v）10分钟在Eppendorf管中对拟南芥种子进行表面消毒，然后分别使用1ml无菌Milli-Q水进行5次洗涤。种子用微量移液器（1,000μl）洗涤（图1A）。
2. 将灭菌的种子在4°C的水中分层72小时，然后使用微量移液管（10μL）在含有半强度MS培养基的方盘平皿上滴加（图1B-1D）。
3. 使用透明塑料包装密封包含种子的盘子。
4. 在22±2℃，16小时光照（150μmolm -2 s -1）和8小时黑暗的情况下，将受控环境生长室中的板竖直孵育9天天（图1E）。
  
  图1.种子灭菌和幼苗生长。：一种。甲。用次氯酸钠溶液50％（v / v）进行表面灭菌过程中的拟南芥种子; B.含有分层种子的移液管尖（已经切割然后高压灭菌）; C.分层种子置于半强度MS培养基中; D.在含有半强度MS培养基的方形培养皿上对齐种子; F.生长在生长室中的拟南芥幼苗（9日龄）。
含有pH敏感指示剂溴甲酚紫的凝胶
1. 准备含有pH敏感指示剂溴甲酚紫的凝胶
  1. 加入0.006％（w / v）溴甲酚紫游离酸试剂级（60g L-1）;在无菌蒸馏水中加入1mM CaSO 4（172g L -1）。使用KOH或HCl调节pH至5.7。将溶液倒入锥形瓶中。
  2. 将琼脂糖（15g L -1）加入锥形瓶中并在微波炉中加热直至完全溶解。
2. 借助于量筒（100ml），将熔化的凝胶倒入培养皿（150×20mm），每皿50ml（约0.4cm厚）。使琼脂糖凝胶冷却直至凝固。（图2）。
  
  图2.凝胶中pH敏感指示剂溴甲酚紫。A.溴甲酚紫; B.硫酸钙（CaSO4·4）; C.琼脂糖; D.溴甲酚紫溶液，无菌蒸馏水pH 5.7; E.溶液在微波中加热直至琼脂糖完全溶解; F.含有溴甲酚紫的凝胶完全溶解并准备倒入。 G.凝胶被倒入培养皿中。 H.含有固化凝胶并准备接种幼苗的平板（顶视图）。 I.在H中显示的板的横向视图。凝胶应该约0.4厘米厚，预计深黄色可以检测到pH差异。
3. 用镊子轻轻转移幼苗组（6-8）至含有pH指示剂溴甲酚紫（pH 5.7）的每个培养皿中（图3A-3B;参见视频1）。
  
  视频1
4. 一旦放入凝胶pH敏感指示剂溴甲酚紫，只用10μlAtRALF1（10μM溶液）或水（10μl作为对照）处理幼苗的根部（见视频2）。
  
  视频2
5. 使用数码相机（Sony，Cyber-shot）在处理后30分钟拍摄图像。

数据分析

产生的数据是定性的，可重复性很高，但幼苗必须仔细操作。通过处理本身可能会无意中造成的创伤是一个信号，可能会导致质子通量并可能导致碱化。
30分钟后，AtRALF1处理的幼苗在根部周围呈现紫色，而水处理的对照幼苗不发色（图3C-3D）。
摄影记录：我们获得的最佳结果是使用白色背景和来自背后的白光源。良好的摄影记录是良好的设备，摄影师技巧和灯光设置的结果。减少平板和白色背景之间的距离会增加凝胶中颜色变化的检测。图3F显示了这种效应的一个例子。

图3.含有溴甲酚紫的凝胶的根部pH变化评估。：一种。选择拟南芥幼苗转移到含有pH指示剂的凝胶上。 B.将幼苗放在凝胶上。 C.在AtRALF1或水处理前对6-8幼苗。 D.在C中显示的同一对，处理后30分钟。 E.在AtRALF1或水处理前6-8对幼苗。 F.处理后30分钟E中显示的相同对。图像是在减少板和白色背景之间的距离后拍摄的。比例尺= 1厘米。

笔记

如do Canto等人所述获得自制产生的6xHis AtRALF1重组肽。（2014）。
根据我们的经验，最重要的重现点是：便于成像的凝胶厚度（0.4厘米）;与肽孵育的时间（30分钟）;保持完整（在处理过程中不应用镊子或任何方式触摸/伤害根部）;和少量用于根处理的肽溶液（10μl）。
将重组AtRALF1（7,631g / mol）溶于蒸馏水（7.631μg/100μl）中。该解决方案的最终浓度是10μM。

食谱

半强度MS培养基
注意：称量称量天平中使用的所有化学物质（±0.0001）。使用磁力搅拌器和pH计调整MS培养基的pH值。
1. 将不含蔗糖和维生素的2.215g L -1 MS盐（PhytoTechnology Laboratories），10.0g蔗糖加入到800ml ddH 2 O中，使用KOH调节pH至5.7， >
2. 加入结冷胶粉（6g L -1，PhytoTechnology Laboratories）并用dH 2 O加入至1L。
3. 在121°C高压灭菌15分钟
4. 高压灭菌后，将半强度MS培养基倒入正方形Petri培养皿中，每个培养皿30ml，借助量筒（100ml）在层流罩中进行。
含溴甲酚紫的凝胶（pH 5.7）
0.006％（w / v）溴甲酚紫（游离酸试剂级）（60g L -1）
1毫摩尔CaSO 4（172克L -1）
无菌蒸馏水
琼脂糖（15克L -1）
次氯酸钠（NaClO）溶液50％（v / v）
50毫升次氯酸钠溶液

50毫升无菌蒸馏水

致谢

本研究得到Fundaçãode AmparoàPesquisa do Estado deSãoPaulo（FAPESP）的支持。帝斯曼是CNPq的研究员。该协议改编自Wu等人（2007）。
作者声明他们没有任何利益冲突或利益冲突。

参考

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