材料和试剂

移液器吸头（USA Scientific，产品目录号：1111-1806，1111-3800）
CELLSTAR过滤瓶盖细胞培养瓶T75（Greiner Bio One International，目录号：658175）
15毫升管
玻璃载玻片（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：4951PLUS4）
盖帽（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：25X25-1）
硅橡胶化合物（PDMS）（Momentive，目录号：RTV615）
PVP处理的PCTE膜，13mm直径，400nm孔（Sterlitech，目录号：PCT0413100）
B16-F10黑素瘤细胞（ATCC，目录号：CRL-6475）
小鼠CD4（L3T4）微珠（Miltenyi Biotec，目录号：130-049-201）
佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）（Sigma-Aldrich，目录号：P1585-1MG）
离子霉素钙盐（Sigma-Aldrich，目录号：I0634-1MG）
Ficoll-paque plus（GE Healthcare，目录号：17144003）
重组小鼠IL-2（Thermo Fisher Scientific，eBioscience TM，产品目录号：14-8021-64）
重组人IL-2（来自康奈尔大学Kendall A. Smith博士的礼物）
胰蛋白酶/ EDTA溶液（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：R001100）
磷酸盐缓冲盐水（Sigma-Aldrich，目录号：P4417）
甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：50046）
卵清蛋白肽SIINFEKL（Sigma-Aldrich，目录号：S7951-1MG）
细胞追踪远红（DDAO-SE）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：C34564）
聚-L-赖氨酸溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P8920-100ML）
多聚甲醛溶液，4％于PBS中（Alfa Aesar，Affymetrix，目录号：J19943）
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：MX0490-4）
Fluoromount水性固定介质（Sigma-Aldrich，目录号：F4680-25ML）
Triton 100-X（MP Biomedicals，目录号：0230022101-1）
α-CD4，Alexa700，Pacific Blue（BD Bioscience克隆RM4-5，BD，目录号：557956,558107）
α-IL-2Rα，PE（Miltenyi Biotec clone 7D4，Miltenyi Biotec，目录号：130-102-593）
第一抗体兔α-磷酸-STAT5（pY694）（Cell Signaling clone C71E5，Cell Signaling Technology，目录号：9314S）
第一抗体兔α-磷酸-STAT1（pY701）（Cell Signaling clone 58D6，Cell Signaling Technology，目录号：9167L）
二级多克隆抗体α-兔IgG，Alexa 488（Jackson ImmunoResearch，目录号：711-176-152）
含L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基（Biological Industries，目录号：01-100-1A）
热灭活的胎牛血清（Biological Industries，目录号：04-127-1A）
HEPES缓冲液（Biological Industries，目录号：03-025-1B）
非必需氨基酸（Biological Industries，目录号：01-340-1B）
丙酮酸钠（Biological Industries，目录号：03-042-1B）
青霉素 - 链霉素溶液（Biological Industries，目录号：03-031-5B）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148-25ML）
完整的RPMI（见食谱）

设备

移液器
带有微板摇摆转子的Heraeus离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Heraeus TM Biofuge TM Stratos TM TM >）
蔡司Axiovert 200M显微镜（蔡司，型号：Axiovert 200M）

软件

MATLAB，Mathworks公司
LabVIEW，National Instruments

程序

这里描述的方案被开发用于在次级淋巴器官或其他实体组织中模拟体内条件的致密细胞因子消耗细胞簇中成像细胞因子信号传导（Oyler-Yaniv等人， / em>，2017）。

细胞培养
1. 从淋巴结和脾收获OT-I和C57BL / 6原代细胞，并机械分离成单细胞悬液。使用小鼠CD4（L3T4）微珠分离CD4 + T细胞。在整个过程中将原代细胞和B16-F10黑素瘤细胞（ATCC CRL-6475）维持在完全RPMI（配方1）中。使用10ng / ml PMA和500ng / ml离子霉素活化C57BL / 6T细胞并在30ml培养基中在T75烧瓶中培养3天。
2. 根据标准方案（Böyum，1968），使用Ficoll-paque加密度梯度培养基去除死细胞，随后在补充有2nM重组人IL-2的RPMI中以10 6细胞/ ml培养另外的细胞天。 IL-2分泌实验在培养的第4天进行。
3. 将B16-F10细胞维持在Tml瓶中的30ml完全RPMI（配方1）中，并使用胰蛋白酶/ EDTA溶液每3天进行传代，并重新培养至10％融合（约10 6细胞每一段的开始）。细胞从来没有用过第7代。
  注：B16-F10黑素瘤细胞表达IFNγ受体，但不产生IFNγ。它们也表达高水平的MHC-I，因此可作为TCR识别的抗原呈递细胞。
制备用于成像的细胞
1. 为了除去受体结合的细胞因子，在10ml PBS中洗涤5×10 7个培养的T细胞（消费者细胞），然后在PBS（pH 4.0）中将0.1M甘氨酸在冰上暴露1分钟，随后每次用10ml RPMI洗涤3次，并在含有RPMI的管中在37℃培养箱中静置1小时。
2. 为了产生CD4耗尽的幼稚脾细胞（惰性细胞），从C57BL / 6小鼠收获淋巴结和脾脏。将组织分离成单细胞悬液。使用小鼠CD4（L3T4）微珠消耗CD4 + / +细胞的细胞悬液。
3. 将培养的消费者细胞与不同比例的惰性细胞混合。
4. 用5ng / ml PMA和500ng / ml伊屋诺霉素重新施用先前活化的T细胞培养物以产生产生IL-2的细胞。这种再激活导致T细胞迅速而广泛地产生IL-2。这些细胞用DDAO-SE通过使用1μM的制造商的方案进行标记以用于随后的鉴定。在这个阶段只有细胞因子生产者被标记！
5. 在培养箱中在10ml RPMI中用10nM的SIINFEKL肽脉冲10 7 B16-F10细胞1小时恒定旋转。
  使用1μM制造商的协议，用DDAO-SE标记OT-I细胞用于后续识别
一般描述：成像设备的制造
1. 通过将聚-L-赖氨酸（PLL）涂覆在含0.01％PLL的稀释于37℃的H 2 O中40分钟，使载玻片与聚-L-赖氨酸（PLL）一起滑动。通过将载玻片浸入大量H 2 O中清洗载玻片并使其在室温下干燥1小时。将一个由PDMS制成的小型（6毫米）中空圆柱体放置在载玻片上，PDMS快速连接到载玻片上，形成一个小孔。
2. 为了产生紧密包装的细胞沉淀，将细胞悬浮液加入到PDMS孔中，将该载玻片置于移液管盒盖内并以800×g离心1分钟以使细胞粘附到载玻片上（图1A）。随着更多细胞在装置上累积，它们形成三维分层结构。根据细胞的大小，每层将包含〜1-2×10 5个单独的细胞。此外，由不同细胞制剂组成的不同层可以依次添加，形成可以模拟特定体内形态的分层结构。
3. 细胞沉积后，去除PDMS孔，并将13mm直径的半透性亲水膜浸入培养基中并小心放置在细胞顶部。该膜可防止因试剂更换而引起的细胞移动，并防止对流流动造成浓度场扭曲。然后将细胞和膜用更大的PDMS孔（12mm直径）覆盖以允许细胞周围的试剂限制。在实验结束时，将细胞在200μl37℃4％PFA中固定20分钟，并通过使用200μl冰冷的90％MeOH透化10分钟。孵育和固定后，与载玻片接触的细胞将永久地与其保持结合，从而保持其空间分布。然后使用镊子将PDMS孔和膜去除，使用标准免疫荧光方案将载玻片染色，最后使用Fluoromount将其安装在盖玻片上（图1B）。该过程如图2所示。
  
  图1.制备用于成像的载玻片。：一种。离心后的PlaneView装置; B.染色和安装后的细胞贴剂。
  
  图2.设备准备的图形协议。用于成像的细胞的制备通过首先用聚-L-赖氨酸（1）涂布载玻片来完成。然后，通过离心将含有少量细胞因子生成细胞的细胞悬液沉积在单层中（2,3）。 10层不含生产者的细胞沉积在顶部以形成三维结构（4,5）。用半透膜（6）覆盖细胞，孵育1小时（7），然后原位固定（8）。然后将细胞透化并染色（9,10）。
细胞因子浓度场的体外成像
1. 为了测量IL-2浓度场（图3），2×10 5 IL-2消耗性T细胞或10％消耗性T细胞的组合（2×10 4 4 / sup ）和90％惰性细胞（1.8×10 5）与0.1％产生IL-2的T细胞（200个细胞）混合，各自总体积为20μl，并沉积在单层。然后，分别将10个不含生产者的细胞层（2×10 6个细胞）和1：0或1：9的消耗者与惰性细胞的比率分别为180μl ，加在顶部，形成三维地层，生产细胞分散在底部（图2）。一个半透膜被放置在细胞上，以在进一步加工过程中保持它们的位置。
  
  图3. IL-2生产者周围的pSTAT5分布。含有100％IL-2Rα+消耗细胞或10％消耗细胞和90％IL-2Rα-惰性细胞的细胞制剂的免疫荧光染色和少量（<0.01％）IL-2产生T在PlaneView成像设备中的细胞。蓝色：DAPI，红色：IL-2Rα，绿色：pSTAT5，品红色：DDAO-SE。
2. 为了测量IFNγ浓度场（图4），将10 5 SIINFEKL脉冲B16-F10黑素瘤细胞与0.2％OT-1 T细胞（200个细胞）混合并以单层沉积。然后，在顶部添加10层更多层的B16-F10细胞（10 <6>）。一个半透膜被放置在细胞上，以在进一步加工过程中保持它们的位置。
  
  图4.在IFNγ生产者周围的pSTAT1分布如程序D中所述制备含有掺有少量OT-1细胞的SIINFEKL脉冲B16-10A细胞的细胞制品的免疫荧光染色。蓝色：DAPI，红色：pSTAT1，绿色：DDAO-SE。
3. 为了控制背景转录因子磷酸化和细胞因子特异性，装置装载有不含生产者的消耗细胞培养物。然后用新鲜培养基或含有10nM细胞因子的培养基覆盖细胞，分别作为阴性和阳性对照。这些样品显示阴性对照没有信号，阳性对照没有明亮，均匀的信号（Oyler-Yaniv等人，2017）。
4. 该系统在37℃孵育1小时。之后，小心吸出培养基并将细胞在37℃下在4％PFA中固定20分钟。然后除去PFA，通过使用200μl冰冷的90％MeOH 10分钟使细胞透化以允许细胞内免疫染色。在这个阶段应该给予特别的关注，以最小程度地破坏细胞团。
5. 固定和透化后，使用镊子将PDMS孔和膜去除。在这个阶段，细胞将紧紧地结合到载玻片上，并且可以使用标准的免疫染色方案。在室温下，在PBS中的5％FBS和0.3％Triton X-100中孵育1小时，封闭非特异性抗体结合。在室温下将一抗（兔抗-pSTAT5 1：200）在湿室中施用1小时。在室温下应用荧光团缀合的抗体（山羊抗兔Alexa 488，大鼠抗IL-2RαR-PE，1：300）1小时。然后用DAPI短暂染色细胞，并使用Fluoromount（图1B）安装盖玻片进行荧光成像。

数据分析

图像通过细分个体细胞进行处理（Gonzalez and Woods，2007），然后根据IL-2Rα表达确定每个细胞是否为消费者。对每个消费者，计算并记录pSTAT5表达的总水平和质心。这个过程的一个例子如图5所示。然后生成单个细胞上pSTAT5表达的图谱，作为离最近生产者距离的函数（图6）。

图5.图像处理程序

图6. pSTAT5分布的分析。：一种。如程序D中所述制备掺有少量产生IL-2的细胞的100％消耗IL-2的T细胞的样品。基于总pSTAT5和每个细胞的质量中心的图像重建。每个圆的半径与pSTAT5电平成正比。 C.pSTAT5特征作为离细胞因子生产者的距离的函数。

食谱

完成RPMI
RPMI 1640媒体补充：
热灭活10％胎牛血清
2 mM L-谷氨酰胺
10 mM HEPES
0.1 mM非必需氨基酸
1 mM丙酮酸钠
100微克/毫升青霉素
100μg/ ml链霉素
50μMβ-巯基乙醇

致谢

这项工作是与GrégoireAltan-Bonnet（NIH）合作完成的，我们要感谢他们的全面支持，特别是对于稿件的批判性阅读。我们也感谢美国和以色列的两国科学基金会（批准号为2012327，授予G.Altan-Bonnet和O.K.）的资金。该协议已被改编自Oyler-Yaniv et。，2017年。
作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

Alves，NL，Richard-Le Goff，O.，Huntington，ND，Sousa，AP，Ribeiro，VS，Bordack，A.，Vives，FL，Peduto，L.，Chidgey，A.，Cumano，A.，Boyd， R.，Eberl，G。和Di Santo，JP（2009）。表征胸腺IL-7生态位在体内。 Proc Natl Acad Sci USA 106（5）：1512-1517。
Böyum，A.（1968）。隔离来自人血液的单核细胞和粒细胞。通过一次离心分离单核细胞，并通过在1g离心和沉降组合离心分离粒细胞。 Scand J Clin Lab Invest Suppl 97：77-89。
Busse，D.，de la Rosa，M.，Hobiger，K.，Thurley，K.，Flossdorf，M.，Scheffold，A。和Hofer，T。（2010）。竞争性反馈环形成了细胞微环境中辅助细胞和调节性T淋巴细胞之间的IL-2信号传导。美国国家科学院院刊 107（7）：3058-3063。
Feinerman，O.，Jentsch，G.，Tkach，K. E.，Coward，J. W.，Hathorn，M. M.，Sneddon，M. W.，Emonet，T.，Smith，K. A.和Altan-Bonnet，G.（2010）。效应细胞和调节性T细胞对IL-2反应的单细胞定量揭示了免疫应答的关键可塑性。 Mol Syst Biol 6：437。
Gonzalez，R.C和Woods，R.E。（2007）。数字图像处理（第3版）。
Höfer，T. O. Krichevsky，O和Altan-Bonnet，G。（2012）。针对调节性和效应性T细胞对凿子免疫反应的IL-2竞争。 Front Immunol 3：268.
Liu，Z.，Gerner，M.Y.，Van Panhuys，N.，Levine，A.G.，Rudensky，A.Y。和Germain，R.N。（2015）。通过共定位的效应子和调节性T细胞强化免疫稳态。 Nature 528（7581）：225-230。
Müller，A.J.，Filipe-Santos，O.，Eberl，G.，Aebischer，T.，Spath，G.F和Bousso，P。（2012）。 CD4 + T细胞依赖细胞因子梯度来控制超出抗原呈递位点的细胞内病原体。“ CD4 + T细胞依赖细胞因子梯度来控制超出抗原呈递位点的细胞内病原体。“目标=“_ blank”> + T细胞依赖细胞因子梯度以控制超出抗原呈递位点的细胞内病原体。免疫 37（1）：147-157。
Oyler-Yaniv，A.，Oyler-Yaniv，J.，Whitlock，B.M.，Liu，Z.，Germain，R.N.，Huse，M.，Altan-Bonnet，G。和Krichevsky，O。（2017）。细胞因子增殖的可调节扩散消耗机制使免疫中细胞间通讯的可塑性成为可能系统。免疫 46（4）：609-620。
Thurley，K.，Gerecht，D.，Friedmann，E。和Hofer，T。（2015）。三在T细胞之间的细胞因子信号传导的三维梯度。
Tokoyoda，K.，Egawa，T.，Sugiyama，T.，Choi，B.I。和Nagasawa，T。（2004）。在发育期间控制骨髓内B淋巴细胞行为的细胞龛。免疫 20（6）：707-718。
Weist，B.M.，Kurd，N.，Boussier，J.，Chan，S.W。和Robey，E.A。（2015）。胸腺调节性T细胞生态位大小是通过限制带有抗原的树突状细胞的IL-2和反馈来规定的竞争。 Nat Immunol 16（6）：635-641。