材料和试剂

标准移液器吸头，容量为10μl，20μl，200μl和1 ml
无核酸酶的1.7-ml微量离心管（Denville Scientific，目录号：C2171）
ThermoGrid TM刚性带0.2ml PCR管[（Denville Scientific，目录号：C18064（1000859）]
MicroAmp光学384孔反应板（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，目录号：4309849）
光学粘合剂膜（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，目录号：4311971）
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：14040-133）
总RNA分离-miRNeasy Mini Kit（QIAGEN，目录号：217004）
（可选）TRIzol试剂（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：15596018）
无核酸酶的水（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM9930）
RiboLock RNA酶抑制剂（40U /μl）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：EO0381）
RNase R（Lucigen，Epicentre，目录号：RNR07250）
dNTP混合物（每种10mM）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：R0193）。
随机引物（150ng /μl）（Sigma-Aldrich，Roche Diagnostics，目录号：11034731001）
Maxima逆转录酶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：EP0741）
KAPA SYBR ®FAST ABI prism 2x qPCR master mix（Kapa Biosystems，产品目录号：KK4605）或其他供应商提供的SYBR Green
QIAquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28704）
TBE缓冲液，10倍分子生物学级（Sigma-Aldrich，目录号：574795-1L）
1 Kb Plus DNA Ladder（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：10787018）
UltraPure TM琼脂糖（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，产品目录号：16500500）
溴化乙锭溶液（Sigma-Aldrich，目录号：E1510-10ML）
2％琼脂糖凝胶（见食谱）

设备

2μl，20μl，200μl和1,000μl手动移液器组（Mettler-Toledo，Rainin，产品目录号：17014393,17014392,17014391和17014382）
细胞刮刀（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：179707PK）
涡旋混合器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：88880018）
紫外透照器
冷冻离心机（Eppendorf，型号：5430 R）
NanoDrop TM One / OneC微量紫外可见分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：NanoDrop One TM TM，产品目录号：ND -ONE-W）
PCR带管转子，微型离心机C1201 [Denville Scientific，目录号：C1201-S（1000806）]
Eppendorf®Thermomixer®C（Eppendorf，型号：Thermomixer®C，目录号：5382000015）
Veriti 96孔热循环仪（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，型号：Veriti TM 96-Well，目录号：4375786）
Owl TM EasyCast TM B1 Mini Gel Electrophoresis Systems（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Owl TM TM） EasyCast TM B1，产品目录号：B1）
凝胶成像系统（ProteinSimple，目录号：FluorChem E系统）
MPS 1000微型平板旋转器（Next Day Science，目录号：C1000）
QuantStudio 5实时PCR系统，384孔（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，型号：QuantStudio TM 5，目录号：A28140）

程序

分歧的引物设计
1. 从UCSC基因组浏览器获取成熟的环状RNA序列（ https://genome.ucsc.edu/ ）使用基因组坐标（注4）。
2. 如图1所示，通过将circRNA 5'末端的3'端100nt序列连接到100nt序列（注5），制作PCR扩增子模板。
  
  图1.来自pre-mRNA反向剪接的circRNA生物合成的示意图（顶部em / em）和使用circRNA连接作为PCR扩增模板的不同引物设计的示意图（ bottom ）
3. 使用上述PCR扩增子模板序列，使用Primer 3 webtool设计PCR引物（ http://bioinfo.ut.ee / primer3 / ）或NCBI引物-BLAST（ http：// www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ ）。
4. 确保PCR扩增子长度在120-200nt之间（注6）。
5. 如果您知道circRNA的CircBase ID（Glazar等人，2014年），您可以使用CircInteractome网络工具设计不同的引物（Dudekula等人，2016年）（ http://circinteractome.irp.nia.nih.gov/Divergent_Primers/divergent_primers.html ）。
总RNA分离
1. 取约200万个培养细胞并除去培养基。
2. 用冷PBS在4°C清洗细胞三次
3. 立即刮细胞，并使用冷DPBS将其转移至1.7-ml管中冲洗平板。
4. 收集细胞颗粒，500×g离心5分钟，4℃。
5. 立即加入700μl的miRNeasy试剂盒中提供的QIAzol裂解试剂，并通过移液破坏细胞沉淀。
6. 使用miRNeasy Kit按照制造商的说明准备总RNA（注1）。
7. 无核酸酶水中的RNA可在-20°C或-80°C下保存6个月，或立即用于RNA酶R消化和cDNA合成。
用RNA酶R消化和cDNA合成降解线性RNA
1. 用NanoDrop分光光度计测量RNA浓度。
2. 准备RNA酶R消化反应，其中包含2μg制备的RNA，1μlRiboLock，2μl10x RNase R反应缓冲液和1μlRNase R;
  使用无核酸酶的水将体积调节至20μl（注2）。
3. 准备与RNase R反应完全相同但没有RNase R的对照反应。
4. 在37°C孵育反应30分钟，立即进行RNA分离。
5. 按照制造商提供的方案，使用miRNeasy试剂盒制备RNA酶R中的RNA，并对照处理的样品，并在40μl不含核酸酶的水中洗脱。
6. 准备cDNA合成反应，包含12μl制备的RNA，1μlRiboLock，1μldNTP混合物，1μl随机引物，4μl5x RT缓冲液和1μlMaxima逆转录酶（注2）。
7. 准备包含除Maxima逆转录酶（注3）以外的所有物质的非RT反应。
8. 轻轻混匀反应液，离心10秒，使反应管底部沉降。
9. 将反应液在25°C孵育10分钟，然后在50°C孵育30分钟进行cDNA合成。
10. 在85°C孵育反应5分钟，使逆转录酶失活
11. 制备的cDNA可以保存在-20°C或立即用于PCR分析。
PCR和circRNA测序
1. 准备正向和反向分歧的引物混合物，在无核酸酶的水中终浓度为1μM，用于circRNA。
2. 准备包含25μl2x SYBR Green混合液，0.1μlcDNA，12.5μl不同引物混合液的PCR反应液，并用无核酸酶的水将体积调节至50μl（注2和10）。
3. 用0.1μlno-RT代替cDNA制备与上述相同的另一个反应。
4. 用手指轻轻敲击试管并离心几秒钟以解决管底反应。
5. 在热循环仪上进行PCR，循环设置为95℃3分钟，35个循环，95℃5秒，加上60℃5秒。
6. 在1x TBE缓冲液中制备含溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶（参见食谱），并在100 V下分离全部50μlPCR产物，直至上样染料达到凝胶的3/4。
7. 在紫外透射仪上显示PCR产物以确认扩增的PCR产物的大小（注7）。
8. 按照制造商的说明书（图2），使用QIAquick凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶中纯化PCR产物。
9. 量化制备的DNA样品中的PCR产物浓度。
10. 使用正向或反向引物对扩增的PCR产物进行序列分析，以找到反向连接序列。
  
  图2.在溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶上解析并显现的circRNA PCR产物的实例在凝胶纯化后提交PCR产物用于DNA测序。
定量PCR（qPCR）分析circRNA
1. 在无核酸酶的水中以1μM的终浓度为目标mRNA和circRNA制备正向和反向引物混合物。
2. 在含有10μl2x SYBR Green混合物，0.1μlcDNA和5μl引物混合物的384孔板中制备qPCR反应。
  用无核酸酶的水将体积调节至20μl（注2和11）。
3. 。用光学胶膜密封平板后，将反应板旋转几秒钟。
4. 旋转板几秒钟以解决在井底部的反应。
5. 使用QuantStudio 5实时荧光定量PCR系统（注2），在95°C设置qPCR反应循环2分钟，95°C 2秒，60°C 10秒，40次循环。
6. 使用表1（注8和9）中所述的ΔCT方法（图3）进行RNA酶R处理后剩下的RNA百分比（％）。
  
  表1.相对于对照，RNA酶R处理后留下的RNA百分比。对照和RNA酶R处理的样品中线性和环状RNA的实例CT值，以及RNA酶R处理后留下的RNA的计算。
  
  图3.假设的qPCR数据显示了circRNA对RNA酶R处理的耐受性，如表1中所计算的。qPCR结果显示RNase R中的circRNA和线性RNA的水平（黑色 >）处理的样品与对照处理（灰色）相比。

数据分析

为了验证circRNA的存在，Sanger测序将在用不同引物扩增的PCR产物上进行（图2）。如从RNA-seq预测的（Panda等人，2017a和2017c），PCR产物序列应该完全匹配预期的circRNA连接序列。然而，这种分析并不能说明后裂缝连接序列是来自杂乱的外显子线性转录本还是真正的后彩膜连接。为了研究这种可能性，用RNA酶R（一种已知降解线性RNA的5'至3'外切核酸酶）消化RNA。如图3所示，接下来的RNA酶R处理后，线性mRNA和mRNA降低到低于10％的水平，而Y em > circRNA未降解（表1）。当RNase R处理减少至最低水平时，对照的线性Y染色体mRNA支持RNA酶R特异性降解线性RNA的观点，即Y染色circRNA水平不显示消耗的事实以富集circRNA群体（图3）（Panda等人，2017c）。

笔记

总RNA也可以用TRIzol试剂（Thermo Fisher Scientific）或任何其他总RNA分离试剂盒制备。
为了避免污染，可以使用PCR工作站来制备用于RNA酶R处理，cDNA合成，RT-PCR和qPCR的反应混合物。
'无RT'cDNA反应可作为cDNA合成的阴性对照，只有低水平背景应在RT-PCR中使用特定引物扩增。
circRNA的成熟序列可以通过连接基因组中的背脊位点坐标之间存在的外显子序列来获得。
如果环形RNA短于200nt，则可以将成熟的circRNA序列分成两半，通过将5'末端的3'末端连接到5'末端可以产生用于引物设计的模板。
扩散引物的PCR扩增子应跨越circRNA backsplice接点;应注意没有引物与连接序列重叠。
琼脂糖凝胶上的PCR产物应该显示预期大小的单一产物，而'无RT'反应不应该放大产物。
每个引物组的解离曲线分析应该显示一个单峰。
CT值应代表三次反应的平均值。 qPCR分析不需要标准化。 RNase R治疗中线性RNA耗竭的实际水平可以通过将其标准化至对应的circRNA水平来估计。
任何 Taq 聚合酶代替SYBR绿色混合物都可用于此PCR反应。
由于吸取0.1μlcDNA很困难且容易出错，根据每个cDNA样品所需的最终反应次数制备cDNA和水的主要混合物。或者，20μl制备的cDNA可用无核酸酶的水稀释至1 ml，5μl稀释的cDNA可用于qPCR反应。

食谱

2％琼脂糖凝胶
2克琼脂糖在100毫升1×TBE中
终浓度约为0.2μg/ ml的溴化乙锭（EtBr）

致谢

ACP得到了科学与技术部门的支持。工程研究委员会，印度政府科学和技术部（DST）的法定机构（SERB / F / 6890 / 2017-18）。 ACP和MG得到了美国国立卫生研究院老龄化，校内研究计划的国家研究所的支持。
他的协议是从以前发表的文章（杜德库拉等人，2016和熊猫等人，2017b）改编的。该议定书由Gorospe实验室，美国国立卫生研究院老年研究所（NIH，Panda等人，2017c和Abdelmohsen等人，2017）中的不同研究人员进行了测试和优化。作者没有利益冲突或竞争利益声明。

参考

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