材料和试剂

移液器吸头（康宁，产品目录号：4713,4712）
1.7ml Eppendorf管（Corning，Costar ，目录号：3620）
T25，T175烧瓶（Corning，目录号：430639,431080）
注射器10cc，20cc（BD，目录号码：302995,302830）
22 G钝针（CML Supply，目录号：901-22-100M）
D3聚碳酸酯膜（GE Healthcare，目录号：110612）
4毫米电穿孔比色杯（哈佛设备，目录号：450126）
24孔板和96孔板（MIDSCI，目录号：TP92024，TP92696）
Coverslips（Fisher Scientific，目录号：12-545-80）
2ml Eppendorf管（Fisher Scientific，目录号：054-08-138）
1升Stericup过滤器（Merck，Millipore Sigma，目录号：SCVPU11RE）
冷冻管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：5000-0050）
5ml，10ml，25ml移液管（Fisher Scientific，目录号：13-676-10H，13-676-10J，13-676-10K）
C18 CSH柱（WATERS，目录号：186005295）
吨。 gondii RHΔ ku80 Δ hxgprt 株（安娜堡密歇根大学医学院Dr. Vernon Carruthers赠送）
Q5用大肠杆菌感受态细胞（New England Biolabs，目录号：E0554S）定点诱变试剂盒
质粒可在 https://www.addgene.org/ 获得
1. pSAG1 :: CAS9-U6 :: sgUPRT（Addgene，目录号：54467）
2. pLinker-BirA-3HA-HXGPRT-LoxP（Addgene，目录号：86668）
3. pLinker-6HA-HXGPRT-LoxP（Addgene，目录号：86552）
4. pLinker-2Ty-HXGPRT-LoxP（Addgene，目录号：86664）
LB肉汤（BD，目录号：244610）
氨苄青霉素（Sigma-Aldrich，目录号：A0166）
质粒提取试剂盒（Macherey-Nagel，目录号：740588.250）
M13反向通用底漆
Q5 DNA聚合酶（New England Biolabs，目录号：M0491S）
PCR Cleanup Kit（Macherey-Nagel，产品目录号：740609.250）
用于组织培养的胰蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：T3924）
霉酚酸（Sigma-Aldrich，目录号：M3536）
黄嘌呤（Sigma-Aldrich，目录号：X4002）
甲醛10％超纯EM级（Polysciences，目录号：04018-1）
小鼠抗HA抗体（BioLegend，目录号：901501）
兔抗GAP45（瑞士日内瓦日内瓦大学医学院Dominique Soldati-Favre博士赠送）
与Alexa Fluor-488（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：A-11001）共轭的山羊抗小鼠IgG（H + L）二抗
IRDye 680CW山羊抗小鼠IgG（H + L）（LI-COR，目录号：926-68070）
链霉亲和素Alexa Fluor-488偶联物（Thermo Fisher Scientific，目录号：S32354）
IRDye 800CW抗生蛋白链菌素（LI-COR，目录号：925-32230）
IRDye 680CW山羊抗兔IgG（H + L）（LI-COR，目录号：926-68071）
与Alexa Fluor-594（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：A-11037）共轭的山羊抗兔IgG（H + L）二抗
液氮
FBS（GE Healthcare，目录号：SH30071.03HI）
20％DMSO
链霉亲和素磁珠（Thermo Fisher Scientific，Pierce TM，目录号：88816）
碳酸氢铵（Sigma-Aldrich，目录号：11213）
DTT
碘乙酰胺（IAM）（Sigma-Aldrich，目录号：I1149）
DUOlink原位Red Starter小鼠/兔（Sigma-Aldrich，目录号：DUO92101）
DMEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：12800017）
碳酸氢钠（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：G7513）
庆大霉素（Sigma-Aldrich，目录号：G1272）
磷酸二氢钾（K 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：1551128）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：1551139）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：793639）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E6758）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
D-生物素（Sigma-Aldrich，目录号：47868）
注意：此产品已停产。
Tris（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
EGTA（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
NP-40（Sigma-Aldrich，目录号：I8896）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
脱氧胆酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：D6750）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B0126）
DOC，脱氧胆酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：30970）
氯化锂（LiCl）（Sigma-Aldrich，目录号：62476）
D10中（见食谱）
Cytomix缓冲液（见食谱）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
D-生物素库存（见食谱）
细胞骨架缓冲液（见食谱）
5倍SDS样品缓冲液（见食谱）
缓冲区1（请参阅食谱）
缓冲区2（请参阅食谱）
缓冲区3（见食谱）
缓冲区4（见食谱）

设备

Eppendorf离心机（Eppendorf，型号：5810 R）
培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：370型）
II类生物安全罩（Baker Co.，型号：SterilGARD II，Class II A / B3型）
BTX ECM-830电穿孔仪（哈佛仪器，型号：ECM 830）
血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：3120）
倒置相差显微镜（尼康仪器，型号：Eclipse TS100）
200μl移液器
Sonic Dismembrator 550（Fisher Scientific，型号：Model 550）
磁力支架（赛默飞世尔科技，产品目录号：12321D）
奥德赛成像系统（LI-COR，型号：Odyssey®CLx）
液氮罐（Airgas，型号：NI230LT22）
Q-exactive HF质谱仪（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Q Exactive TM HF）

软件

sgRNA选择网站： http://grna.ctegd.uga.edu/ ，Mascot 2.5版。 1（Matrix Science）
SFINX分析网站： http://sfinx.ugent.be/ ，脚手架版本4.6.1（Proteome Software Inc 。）

程序

设计针对特定基因的Cas9 / sgRNA质粒用于BirA的C端标记
注：此处描述的方案来自Shen等人，2017。我们建议您在尝试此协议之前阅读此评论，以了解弓形虫中CRISPR基因组编辑的背景。
1. sgRNA选择
  1. 在 http://toxodb.org/toxo/ 中，导航到您感兴趣的基因（GOI）网页。这可以使用基于表达或功能特性的基因搜索或仅通过输入已知的基因ID或关键字来完成。小心选择正确的 T。 gondii 拉紧你的工作。将起始密码子上游500bp下游的基因组序列下载到终止密码子下游500bp下游。
  2. 复制终止密码子后的前200 bp，并在 http://grna.ctegd.uga.edu/。输入工作名称，选择 T. gondii 沿袭数据库，并保留所有其他默认设置。
  3. 从生成的sgRNA序列列表中选择具有3'NGG原型间隔区相邻基序（PAM）基序的20nt sgRNA序列。 sgRNA序列可以在正向或反向DNA链上。
2. 产生含有基因特异性sgRNA的Cas9 / sgRNA质粒
  1. 订购用于PCR诱变pSAG1 :: CAS9-U6 :: sgUPRT（Addgene＃54467）的DNA寡核苷酸。反向引物（5'-AACTTGACATCCCCATTTAC-3'）对于用该Cas9 / sgRNA质粒进行的所有诱变反应是通用的。正向引物（5' - [5'至3'方向上的20nt sgRNA序列] -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'）对于每个sgRNA将是唯一的。例如，如果所需的原型间隔子 + PAM 位点是5'-GCTGGTCTATCGCTAGCTCG AGG ，则正向引物将是5' - GCTGGTCTATCGCTAGCTCG GTTTTAGAGCTAGAAATAGC。个别基因的具体例子可以在这些最近的论文中找到（Brown等人，2017; Long等人，2017a和2017b）。
  2. 使用Q5定点诱变试剂盒（New England Biolabs）突变pSAG1 :: CAS9-U6 :: sgUPRT（Addgene＃54467）的sgRNA序列。我们推荐由6.25μl2x Q5热启动酶混合物（包含在试剂盒中），0.625μl每种引物（工作原液10μM），1μl（1 ng）pSAG1 :: CAS9-U6 :: sgUPRT和4 μlddH 2 O。对于热循环，我们建议25个循环的95℃30秒，60℃20秒和72℃5分钟。
  3. 将1μl的PCR反应溶解在DNA凝胶上以确认与约10kb的DNA带成功反应。根据制造商的说明，用KLD混合液（包含在试剂盒中）提取1μlQ5 PCR反应。
  4. 将2.5μl的KLD反应转化为所提供的 E。大肠杆菌感受态细胞，并在含有100μg/ ml 37℃氨苄青霉素的LB琼脂平板上生长过夜。
  5. 增长三个单一的殖民地的E。在含有100μg/ ml氨苄青霉素的3ml LB培养基中于37℃过夜。使用3000 x g离心10分钟沉淀细菌培养物。使用质粒提取试剂盒（Macherey-Nagel）从细菌沉淀中提取质粒。发送三个质粒用于Sanger测序以确认使用M13反向通用引物成功将sgRNA插入Cas9 / sgRNA质粒中。选择序列确认的质粒进行进一步编辑。
使用CRISPR / Cas9标签生成BirA标签生产线
1. 生成基因特异性BirA标签盒
  1. 设计用于扩增BirA标签盒的正向和反向引物。正向引物含有位于终止密码子正上游的40nt 5'同源性（注意终止密码子被排除），并且跟随GCTAGCAAGGGCTCGGGC用于锚定在标记质粒中的接头pLinker-BirA-HXGPRT-LoxP（Addgene＃ 86668）。接头位于标签BirA的前面，用作标签和内源蛋白质之间的间隔区。它也可以作为正向引物的锚定位点。反向引物含有与sgRNA序列（PAM位点上游3bp）处的Cas9切割位点相邻的40nt 3'同源臂，并且随后与ATAGGGCGAATTGGAGCTCC一起用于锚定在标记质粒中的HXGPRT选择盒的末端。推荐的合成规模为25 nmole DNA和寡核苷酸应使用标准脱盐程序进行处理。
  2. 使用制造商的Q5 DNA聚合酶（New England Biolabs）方案在90μlPCR反应中用正向和反向引物扩增BirA盒（图1）。使用标记质粒（1ng，反应90μl）作为DNA模板，退火温度设定为60℃2分钟。
  3. 在DNA凝胶上解决2μlPCR反应，以确认是否存在3.5 kb PCR产物的成功反应。
    
    图1.CRISPR / Cas9标记策略的示意图使用短同源性区域将Cas9位点特异性切割与整合结合的效率允许对感兴趣的基因进行快速标记。将由42bp侧翼区（表示为HR1（紫色）和HR2（蓝色））组成的基因特异性同源区与保守的接头区（L（红色）和T（黑色））组合以产生扩增子。保守连接子位于包含BirA标签（绿色），终止密码子和通用3'UTR（黄色）的中央标签构建体的侧翼。引物HR1和HR2用于从标签质粒中扩增基因特异性BirA扩增子。然后将BirA标签盒克隆到基因特异性pCas9 / sgRNA质粒中并转染到RHΔku80系中，然后进行药物选择。图改编自（Long等人，2017a）。
2. 转染入T。 gondii 收件人行和筛选克隆线
  注意：在本协议中，所有对活宿主细胞或寄生虫的处理都应使用BSL2认证的生物安全柜或通风橱中的无菌技术进行。
  1. 根据制造商的协议，用Gel Extraction和PCR Cleanup Kit（Macherey-Nagel）纯化BirA盒。
  2. 通过加入10-15μlCas9 / sgRNA质粒（10-20μg质粒）洗脱DNA盒，并再次用5μlddH 2 O洗脱柱以制备盒-Cas9 / sgRNA混合物。
  3. 在1.5ml Eppendorf管中于75℃加热盒-CS9 / sgRNA混合物10分钟，并离心以收集壁上的液体。
  4. 在含有D10培养基（配方1）的T25烧瓶中，在37℃，5％CO 2培养箱中培养人类包皮成纤维细胞（HFF），直到它们达到融合。使用标准细胞培养技术将HFF细胞胰蛋白酶消化，以1：4分开传代细胞。
  5. 在T25瓶中感染完全融合的HFF单层，其中T.gondii线以每个T25烧瓶2.5×10 6个寄生虫的密度标记。在这里， T。 gondii 使用RHΔ ku80 Δ hxgprt 。发展 T。 gondii 行约2天，直到从HFF单层发生自然出口。转染后需要新鲜的HFF培养瓶。
  6. 为了收获寄生虫，刮掉单层以从烧瓶中取出并收集5ml含有寄生虫的培养基。释放任何剩余的细胞内T细胞。通过使用10ml注射器穿过22G针头，小心取出针头并将其安全地丢弃到锐器容器中，并且通过穿过3.0μm聚碳酸酯膜过滤寄生虫以去除宿主细胞碎片。将流出物中的寄生虫在800×g，18℃下离心10分钟，并用10ml细胞混合缓冲液（Soldati和Boothroyd，1993;方案2）洗涤寄生物沉淀一次，然后离心再次重新悬浮。来自单个TFF的HFF的典型产量总共约5-8×10 7个寄生虫。
  7. 将从T25中收获的寄生虫重悬于2ml细胞混合缓冲液中用于转染。
  8. 在4mm电穿孔比色杯（BTX）中将200μl寄生虫悬液（5-8×10 6寄生虫）和盒-CSa9 / sgRNA混合物（图1）合并，并进行电穿孔使用以下协议：使用BTX ECM-830电穿孔仪获得1,700 V，176μsec的脉冲长度，两个100 ms间隔的脉冲。
  9. 在电穿孔后立即将寄生虫悬浮液转移到具有融合HFF的新鲜T25烧瓶中，并在37℃，5％CO 2下孵育它们。
  10. 电穿孔和恢复后24小时，开始用25μg/ ml麦考酚酸补充25μg/ ml黄嘌呤进行药物选择。在药物选择培养基中根据需要传代寄生虫直至出现耐药性人群（〜2-3代）。
  11. 在自然出口后，用血细胞计数器计数寄生虫，并将寄生虫稀释至3个寄生虫/150μl，并将该稀释的寄生虫加入150μlD10培养基中至具有融合HFF的96孔板中，并在37℃，5％ CO <2>连续6天不动。
  12. 在倒置相差显微镜下观察在96孔板中仅含有一个噬菌斑的孔。对于只含有一个弓形虫噬菌斑的孔，用200μl移液管在孔中混合寄生虫和培养基。继续生长寄生虫3天，直到寄生虫天然出口。斑块形成和扩张的协议。在微滴定孔板中的弓形虫也已经在之前被充分描述过（Roos等，1994）。
  13. 从孔中挑选10个克隆并在96孔板中用HFF接种一半培养物，另一半接种在具有盖玻片和HFF单层的24孔板中。让盖玻片上的寄生虫生长24小时，并用含4％甲醛的PBS（配方3）固定，并用含有10％FBS的PBS中的0.25％Triton X-100进行膜透化，然后用间接荧光显微术使用初级针对HA（小鼠）和GAP45（兔）的抗体，然后分别与Alexa Fluor 488和594缀合的针对小鼠和兔的二抗。然后在荧光显微镜下观察寄生虫，看看HA染色阳性的克隆（绿色通道）。
  14. 用于测试在靶向基因座处插入BirA的诊断性PCR用于确认使用位于翻译终止密码子上游200bp处的一个引物和位于终止密码子下游300bp处的另一个引物的克隆纯度。正确地标记了 T。 gondii克隆不产生内源性PCR产物，该产物仅从亲本细胞系RHΔ ku80 Δ hxgprt 检测到。
  15. 还可以使用商业抗HA抗体和用于检测的第二抗体进行Western印迹以确认内源性BirA-3HA标签系的表达。对于蛋白质印迹，我们通常每道加载10 6个细胞当量并在转移到硝酸纤维素之前通过在10％PAGE凝胶上分离来解析。我们用LI-COR IR染料二抗检测的首选方法;然而，最佳负载条件可能会因检测方法而异。先前已经详细描述了用于检测弓形虫中表位标签化蛋白质的方案（Brown等人，2017; Long等人，2017a，2017a和2017b）。
  16. 一旦确认阳性克隆，应将它们转移到T25烧瓶中并保存在液氮储存的冷冻小瓶中。五百万寄生虫应该接种在T25烧瓶并且生长1天。感染的HFF单层应该用温PBS洗涤两次，并用1ml胰蛋白酶溶液进行胰蛋白酶消化以分离单层（用等体积的PBS稀释）。应在D10培养基中加入1ml 50％FBS终止胰蛋白酶消化，然后在D10培养基中加入1ml 20％DMSO进行保存。将混合物转移到冷冻管中并放入异丙醇容器中在-80℃下冷冻。
    第二天将冷冻管转移到液氮箱中。
用于质谱分析的生物素化蛋白质的纯化
1. 确认体内BirA活性
  1. 在含有HFF单层（含有5ml D10培养基）的T25烧瓶中，在37℃，5％CO下，将RHΔku80Δhxgprt系和BirA标记系增长24小时在培养箱中加入50μl16mM D-生物素溶液（配方4）于DMEM中以使终浓度为160μM。将寄生虫再生长20小时。
  2. 通过穿过22G针头和D3聚碳酸酯膜来收获寄生虫以去除HFF碎片，并且在800℃×g，18℃下收集流通和离心10分钟以沉淀寄生虫。用冷PBS清洗寄生虫以除去多余的生物素，然后用80μlPBS离心并重新悬浮寄生虫沉淀，并加入20μlSDS样品缓冲液。
    在100°C煮沸样品5-10分钟。
  3. 使用SDS-PAGE分解寄生虫裂解物，并使用链霉亲和素-800CW（LI-COR）进行蛋白质印迹以检测寄生虫系中的生物素化蛋白质。 BirA泳道应该显示在亲本RHΔemuΔ hxgprt 行中未发现的额外条带，如图2A中用CaM1-BirA和CaM2-BirA所示。 >
  4. RHΔ ku80 hxgprt 线和BirA线也可以在具有HFF单层的盖玻片上在24孔板中生长并添加160μMD-生物素24小时，并用于通过使用链霉亲和素Alexa Fluor 488的间接免疫荧光显微镜检测来检测BirA蛋白定位处的生物素化蛋白质（图2B）。
2. 生物素化蛋白的纯化（图2C）
  1. 在含有汇合的HFF单层的T175烧瓶中以2×10 7 / s的剂量接种亲本系RHΔ hxgprt 线和BirA标签线>寄生虫并生长24小时，并添加D-生物素至最终浓度为160μM。
    将D-biotin的寄生虫继续生长20小时，直到天然出口。
  2. 通过穿过22G针头和D3聚碳酸酯膜来收获寄生虫以去除碎片，离心并用50ml冷PBS洗涤寄生虫沉淀三次以去除多余的D-生物素。
  3. 在2毫升细胞骨架缓冲液中重悬寄生虫（方案5），并使用设置：15秒脉冲，15秒间隔时间和2分钟总脉冲时间，用Sonic Dismembrator 550（Fisher Scientific）中的微尖超声波再悬浮。
  4. 在冰上孵育寄生虫裂解10分钟，并转移至2ml Eppendorf管中，并以20000×g，4℃离心20分钟。将上清液转移至新鲜试管中，重复离心以获得更清澈的上清液。
  5. 将上清液转移至2ml含有50μl链霉抗生物素蛋白磁珠（Pierce）的Eppendorf管中，所述磁珠已经用细胞骨架缓冲液洗涤并平衡三次。
    重悬上清液和珠子，并在4°C孵育过夜。
  6. 用1.5ml细胞骨架缓冲液洗珠两次，然后用1.5ml缓冲液1（配方6）洗涤一次，用1.5ml缓冲液2（配方7）洗涤两次，用1.5ml缓冲液3（配方8）洗涤一次，用1.5ml缓冲液4（配方9）和1.5ml PBS两次。每个清洗步骤需要孵育5分钟，最后两个清洗步骤用缓冲液4和PBS进行以除去剩余的SDS。用磁力架将珠子拉下，弃上清。
  7. 转移10％来自最后一次洗涤步骤的珠子，并将珠子重悬于20μlPBS和5μl5x SDS样品缓冲液（配方6）中，用链霉亲和素LI-COR C800进行SDS-PAGE和蛋白质印迹检测。珠子的剩余部分（90％）可以暂时储存在-80°C。
    
    图2. T. gondii 中BirA标签的策略和示例。：一种。蛋白质印迹检测表达CaM1-BirA或CaM2-BirA的RHΔku80Δhxgprt系中的生物素化蛋白质。使用IRDye 800CW链霉抗生物素蛋白来检测生物素化蛋白质。使用α-HA抗体来检测BirA-3HA融合，并且使用α-醛缩酶作为上样对照，并且通过IRDye 680CW山羊抗小鼠IgG和IRDye 680CW山羊抗兔IgG分别可视化。 B.IFA检测CaM1-BirA系中的生物素化蛋白质。链霉抗生物素蛋白Alexa Fluor-488用于检测生物素化蛋白质，并且通过α-HA抗体检测到CaM1-BirA-3xHA，并用与Alexa Fluor 599缀合的抗兔二抗显色。比例尺=2μm。 C.从表达BirA的表达纯化生物素化蛋白质的图。 gondii 行。如方法中所述，将寄生虫溶解并通过链霉抗生物素蛋白珠捕获生物素化蛋白质。此图基于（Roux et。，2012）中的原始描述。
生物素化蛋白的质谱分析（由Michael Naldrett博士在Lincoln内布拉斯加大学生物技术中心蛋白质组学和代谢组学设施完成（ https://biotech.unl.edu/ ）
1. 样品制备
  1. 将样品珠溶解在200μl100 mM碳酸氢铵中，并在37°C下加入4μl2 mM DTT 1小时以减少。
  2. 通过在22℃在黑暗中加入22μl100mM碘乙酰胺（IAM）20分钟来烷基化。
  3. 每个样品加入胰蛋白酶（5μl，0.1mg / ml），并在37℃过夜消化。
2. LC-MS / MS
  在0.075 x 250 mm C18 Waters CSH柱上使用2 h梯度，在NanoLC-MS / MS上运行5μl胰蛋白酶消化样品，进样至Q-exactive HF质谱仪。
3. 光谱分析
  1. 使用Mascot通过搜索质谱来分析质谱的结果。假设通过胰蛋白酶消化的弓形虫ME49_20150114（8322序列），cRAP_20150130（117序列）和习惯（含有链霉抗生物素蛋白序列）数据库。
    吉祥物是通过0.060 Da的碎片离子质量容差和10.0 PPM的母离子容差进行检索的
  2. 在天冬酰胺和谷氨酰胺脱酰胺的过程中，甲硫氨酸，半胱氨酸的氨基甲酰甲基以及赖氨酸的生物素和N-末端的氧化应在Mascot中规定为可变修饰。
  3. 使用Scaffold 4.6.1版来验证基于MS / MS的肽和蛋白质鉴定。基于Scaffold delta质量校正（Keller等人，2002），肽识别被认为是有效的，如果它们支持超过95.0％的概率。我们通常接受蛋白质鉴定，如果它们的建立概率大于99.0％并且包含至少2个鉴定的肽。较低的临界值也可以用于探索性工作，但可能会导致更多的误报识别。
推定的相互作用蛋白的确认
注意：建议将此步骤作为BioID实验的后续步骤，但可能需要几个月才能完成。一些BioID实验可能只需要对诱饵-BirA'邻居'进行调查而不验证特定的交互者。
1. 推定的相互作用蛋白的定位
  1. 在蛋白质相互作用组中鉴定出的相互作用蛋白可能以前没有定位过。为了验证在正确的位置可能的交互，验证其本地化将是第一步。
  2. 候选蛋白质编码基因可以使用CRISPR标记策略通过HA或Ty表位标签内源标记，如上面关于BirA标签所述。唯一的区别是，PCR模板中的BirA标签被替换为HA或Ty标签以生成标签盒。这里我们推荐保存在Addgene pLinker-6HA-HXGPRT-LoxP（＃86552）和pLinker-2Ty-HXGPRT-LoxP（＃86664）中的质粒。
  3. 一旦产生HA或Ty标签菌株，就可以在24孔板的盖玻片上用HFF单层培养菌株进行间接免疫荧光显微镜检查。
  4. 与诱饵蛋白共定位的相互作用蛋白将继续用于ToxoDB的生物信息学分析，如细胞区室，分子功能。
  5. 蛋白质复合物的稳定性和功能可以通过使用生长素诱导性决定子系统（Long等人，2017a; Brown等人， 2017年）。使用生长素诱导性决定子系统的详细方案也可在Bio-protocol（Brown等人，2018年）上获得。
2. 通过另一种接近途径 - 接近结扎测定（PLA）进行相互作用确认
  1. 使用上述CRISPR / Cas9标记策略，通过用HA标记一个基因和用Ty在同一行中标记另一个基因可进一步证实蛋白质相互作用。在这种情况下，推荐Ty标签质粒携带另一个抗性标记DHFR而不是HXGPRT。
  2. 在一个弓形虫线中的HA标签和Ty标签可以被兔HA和小鼠Ty抗体识别，然后是相应的与PLA探针缀合的第二抗体。 PLA程序可以遵循制造商的协议，使用DUOlink原位红色启动试剂盒（Sigma-Aldrich）。 PLA方法在30 nm距离内检测蛋白质相互作用，与BirA标记的距离相似（≤30 nm）（Soderberg et al。2006年）。

数据分析

蛋白质相互作用分析
直接过滤索引（SFINX）（ http://sfinx.ugent.be/ < ）是一个程序，它提供了一个统计学上可靠的方法来过滤假阳性，并使用来自蛋白质组学研究的肽计数来确定真正的相互作用（Titeca等，2016）。在这里，我们将邻近标记方法与此程序相结合，以建立基于接近度的蛋白质 - 蛋白质相互作用网络。
SFINX分析：

来自两个或多个独立实验的数据集应该合并成一个Scaffold文件。将程序设置为“总独特肽数”，蛋白质阈值为95％，肽2的数量最少。
使用'当前视图'导出数据集，并编辑excel文件以删除不必要的列和行，留下基因登录号，独立质谱实验（项目）的名称和肽数。按照SFINX网站在信息栏中的建议，在第一列的第一行中输入行名称。将此基本文件保存为逗号分隔值文件（.csv）或软件建议的其他文件格式。
在实验中用BirA标记感兴趣基因的登录号创建另一个.csv文件（诱饵文件）。
将基本文件和诱饵文件上传到网站并选择正确的文件格式。蛋白质 - 蛋白质网络将立即生成，并在左边显示一个严格条。严格栏是基于SFINX评分（来源于 P 评分），该评分用于对真正的评分进行排名。在我们的例子中，严格性1被采用，对应于 P ＆lt; 0.00004。
通过点击'complete output'或'cutoff output'可以将过滤的数据作为excel .tsc文件下载。下载的文件列出了交互者（preys），以及评分和交互者与BirA蛋白质（诱饵）之间相互作用的得分和 P 得分。
为了用SFINX 3产生高质量的蛋白质 - 蛋白质相互作用网络，应当通过质谱法分析涉及相同途径或位置的多个诱饵蛋白质（即，emA，em，BirA融合蛋白）。

笔记

我们还成功地使用了Scaffold中提供的统计特征来定义重复数据集之间的有意义的交互。当从重复实验进行比较时，我们使用Student's t - 测试来分析数据，无论是否进行多重比较校正。校正后的测试要严格得多，因此不太可能发现误报。然而，它们也极大地限制了潜在的相互作用蛋白质的数量。如果发现是主要目标，那么接受更高的误报率并使用一些次级分析验证潜在的相互作用可能是更好的策略。
使用DHFR耐药盒时应特别小心，因为这会赋予对最常用于治疗弓形体病的药物乙胺嘧啶的抗性。这些质粒的设计是在DHFR耐药盒侧翼的loxP位点上进行的，可以通过瞬时转染Cre来消除该区域，通过PCR进行克隆和筛选。
为了获得SFINX的最佳性能，重要的是对于每种BirA标记的蛋白质具有两个或更多个生物学重复。该方法对重复样品之间标记效率的差异非常稳健，但是，在实验运行之间具有相似的整体肽覆盖度是有帮助的。根据我们的经验，SFINX在预测超过统计阈值的交互作用方面相当保守，因为这不太可能是偶然的。输出文件给出后验概率，可用于设置用户可以接受的阈值。在任何情况下，这些输出只能预测邻近相互作用，并且需要使用其他方法进行后续分析以确认相互作用。

食谱

D10中等
1包DMEM粉末
3.7克碳酸氢钠
2.38克HEPES
10毫升的200毫米L-谷氨酰胺
1毫升10毫克/毫升庆大霉素
适量用去离子H 2 O至1L加入用1升Stericup过滤器过滤灭菌并在4°C储存。
Cytomix缓冲液
8.66mM K 2 HPO 4 4 1.36 KH 2 PO 4 4
120 mM KCl
0.15 mM CaCl 2 2/2 5mM MgCl 2·/ 2 25 mM HEPES
2 mM EDTA
调整pH值至7.6
用Stericup过滤器过滤灭菌并在4°C储存。
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
137mM NaCl
10 mM磷酸盐
2.7 mM KCl
调整pH值到7.4

高压灭菌器在4°C储存
D生物素库存
DMEM中160 mM D-生物素
细胞骨架缓冲区
10 mM Tris，pH 7.4
100 mM NaCl
1 mM EDTA
1 mM EGTA
1％Triton X-100
1％NP-40
10％甘油
0.2％SDS
0.5％脱氧胆酸
5倍SDS样本缓冲区
溴酚蓝0.25％
DTT 0.5 M
甘油50％
SDS 10％
缓冲区1
20 mM Tris pH 7.5
2％SDS
缓冲区2
0.1％DOC
1％Triton X-100
500 mM NaCl
1 mM EDTA
50毫米HEPES
调整pH值至pH 7.5
缓冲区3
250 mM LiCl
0.5％NP-40
0.5％DOC
1 mM EDTA
10 mM Tris pH 8.1
缓冲区4
50 mM Tris，pH 7.4
50 mM NaCl

致谢

这项工作得到了NIH（AI034036）对L.D.S.的资助。该协议根据Long et al。（2017a和2017b）中描述的协议进行改编。作者声明没有冲突或利益冲突。

参考

Brown，K. M.，Long，S.和Sibley，L. D.（2017）。 N-酰化的质膜结合决定了弓形虫的PKG功能。 MBio 8（3）。
Brown，K.M.，Long，S。和Sibley，L.D。（2018）。使用生长素诱导性决定子（AID）融合在<弓形虫弓形虫中进行蛋白质的条件敲除< / a> Bio-protocol 8（4）：e2728。
Chen，AL，Kim，EW，Toh，JY，Vashisht，AA，Rashoff，AQ，Van，C.，Huang，AS，Moon，AS，Bell，HN，Bentolila，LA，Wohlschlegel，JA和Bradley，PJ ）。 BioID揭示的弓形虫内膜复合物的新组分。 a> MBio 6（1）：e02357-02314。
Chen，AL，Moon，AS，Bell，HN，Huang，AS，Vashisht，AA，Toh，JY，Lin，AH，Nadipuram，SM，Kim，EW，Choi，CP，Wohlschlegel，JA和Bradley，PJ（2017）。对弓形虫 IMC缝合线的组成和功能的新见解< / a> Cell Microbiol 19（4）。
Gaji，R.Y.，Johnson，D.E.，Treeck，M.，Wang，M.，Hudmon，A。和Arrizabalaga，G。（2015）。 TgCDPK3磷酸化肌球蛋白运动促进<弓形虫期间动力的快速启动 egress。 Pathog 11（11）：e1005268。
Keller，A.，Nesvizhskii，A.I。，Kolker，E。和Aebersold，R。（2002）。用经验统计模型来估计MS / MS和数据库检索所产生的肽标识的准确性。 Anal Chem 74（20）：5383-5392。
Kim，D.I.，Birendra，K.C.，Zhu，W.，Motamedchaboki，K.，Doye，V。和Roux，K.J。（2014）。探索邻近依赖性生物素化的核孔复杂结构 Proc Natl Acad Sci USA 111（24）：E2453-2461。
Long，S.，Brown，K.M.，Drewry，L.L.，Anthony，B.，Phan，I.Q.H。和Sibley，L.D。（2017a）。定位于锥形的钙调蛋白样蛋白调节弓形虫的运动性和细胞侵袭。 PLoS Pathog 13（5）：e1006379。
Long，S.，Anthony，B.，Drewry，L. L.和Sibley，L. D.（2017b）。含有保守锚蛋白重复序列的蛋白调节弓形体的稳定性，运动性和细胞侵袭性<弓形虫。 Nat Commun 8（1）：2236.
Nadipuram，S.M.，Kim，E.W.，Vashisht，A.A.，Lin，A.H.，Bell，H.N.，Coppens，I.，Wohlschlegel，J.A。和Bradley，P.J。（2016）。体内生物素化弓形虫 parasitophorous液泡显示新的致密颗粒蛋白质对寄生虫生长和发病机制是重要的。 MBio 7（4）。
Roos，D.S。，Donald，R.G.K。，Morrissette，N.S。和Moulton，A.L。（1994）。原生动物寄生虫基因解剖的分子工具弓形虫。 a> Methods Cell Biol 45：28-61。
Roux，K. J.，Kim，D. I.，Raida，M.和Burke，B。（2012）。混杂的生物素连接酶融合蛋白识别哺乳动物细胞中的近端和相互作用蛋白。 > J Cell Biol 196（6）：801-810。
Shen，B.，Brown，K.，Long，S.和Sibley，L. D.（2017）。开发CRISPR / Cas9用于弓形虫中的高效基因组编辑。< / a> Methods Mol Biol 1498：79-103。
Shen，B.，Brown，K.M.，Lee，T.D和Sibley，L.D。（2014）。使用CRISPR / Cas9对不同弓形虫株进行高效基因破坏。 MBio 5（3）：e01114-01114。
Soderberg，O.，Gullberg，M.，Jarvius，M.，Ridderstrale，K.，Leuchowius，KJ，Jarvius，J.，Wester，K.，Hydbring，P.，Bahram，F.，Larsson，LG和Landegren， U.（2006）。通过邻近连接直接观察个体内源性蛋白质复合物原位 / a> Nat Methods 3（12）：995-1000。
Soldati，D.和Boothroyd，J.C。（1993）。专性细胞内寄生虫瞬时转染和表达弓形虫。科学 260（5106）：349-352。
Titeca，K.，Meysman，P.，Gevaert，K.，Tavernier，J.，Laukens，K.，Martens，L。和Eyckerman，S。（2016）。 SFINX：直接筛选亲和纯化 - 质谱数据分析的指标 J Proteome Res 15（1）：332-338。
Van Itallie，C.M.，Aponte，A.，Tietgens，A.J。，Gucek，M.，Fredriksson，K.and Anderson，J.M。（2013）。 ZO-1的N和C末端被不同的蛋白质和功能性蛋白质网络包围。 J生物化学杂志288（19）：13775-13788。