材料和试剂

丁腈手套
无RNA酶的微量离心管（1.5ml）（例如，Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，目录号：AM12450）。
2.5 mm / 250μm/ 40μm/ 10μm的筛网
50毫升试管（Corning，Falcon ，目录号：352070）
纸巾
显微镜载玻片和盖玻片（如，Fisher Scientific，目录号：12-544-1）
高压灭菌刀片
无RNase滤芯，例如
20微升的提示（梅特勒 - 托利多，Rainin，目录号：17007957）
200微升的提示（梅特勒 - 托利多，Rainin，目录号：17002927）
1,000μl吸头（梅特勒 - 托利多，Rainin，目录号：17014361）
（10,000）或寄生虫阶段（50），根结线虫（例如，，M。incognita 莫雷洛斯菌株，M。enterolobii Godet菌株））
DIG标记的ISH探针（多种）
注意：有关探针合成和存储的信息，请参阅程序A.
正向和反向引物设计为允许大约200bp的扩增子大小（例如来自Eurogentec的SePOP脱盐寡聚体）。
PCR级dNTPs（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：10297117）
Pfu DNA聚合酶（Promega，目录号：M7741）
QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28104）
QIAquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28704）
地高辛（DIG）DNA标记试剂盒（Roche Diagnostics，目录号：11175025910）
TE缓冲液pH 8（10mM Tris-HCl，1mM EDTA）（例如，Sigma-Aldrich，目录号：93283）。
RNaseZap RNase去污溶液（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，产品目录号：AM9780）
70％乙醇
自来水
丙酮（，例如，VWR，目录号：20065.293）
甲醇（例如，VWR，目录号：20847.307）
抗地高辛配基-AP-Fab片段标记混合物（Roche Diagnostics，目录号：11093274910）
BCIP 5-溴-4-氯-3-吲哚基 - 磷酸酯，4-甲苯胺盐（Roche Diagnostics，目录号：11383221001）
NBT 4-硝基蓝四唑氯化物（Roche Diagnostics，目录号：11383213001）
Pectinex（Sigma-Aldrich，目录号：P2611）
Celluclast （Sigma-Aldrich，目录号：C2730）
磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S7907）
磷酸钾一元（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P9791）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
硫酸镁（MgSO 4·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：63138）
蔗糖（例如，Sigma-Aldrich，目录号：S9378）
10x PBS（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM9624）
37％甲醛溶液（Sigma-Aldrich，目录号：F15587）
注意：此产品已停产。
蛋白酶K 20mg / ml（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM2546）
去甲基化甲酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：F9037）
SSC缓冲液20x（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM9770）
勃林格封闭剂（Roche Diagnostics，目录号：11096176001）
SDS（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15553027）
Denhart的解决方案（Sigma-Aldrich，目录号：D2532）
EDTA pH 8（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM9261）
鲑鱼精子DNA（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15632011）
来自面包酵母（Sigma-Aldrich，目录号：R8759，型号X-SA）的tRNA
马来酸（Fisher Scientific，目录号：10348843）
制造商：Acros Organics，产品目录号：125230051。
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
氢氧化钠（NaOH）（VWR，目录号：28245.298）
Tris-碱（例如，Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
浓HCl（VWR，目录号：20248.295，类型35％）
去离子水
无核酸酶的水（未经DEPC处理; Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM9938）
线虫提取（见食谱）
1. Pectinex ®和Celluclast® mix
2. M9缓冲液pH 7
3. M9缓冲液中有50％蔗糖
4. 无RNase 1x PBS
对于探针，固定和杂交，无核酸酶（见食谱）
1. 固定缓冲液
2. 1毫克/毫升蛋白酶K溶液
3. 来自贝克酵母的tRNA
4. 杂交缓冲液（HB）
5. 洗涤缓冲液1（4x SSC + 0.1％SDS）
6. 洗涤缓冲液2（0.1x SSC + 0.1％SDS）
7. 10％勃林格封闭剂
8. 过滤马来酸缓冲液，pH 7.5
9. Tris-HCl pH 9.5
10. 碱性磷酸酶检测缓冲液pH 9.5（APB）

设备

Pipetmens（例如，Gilson，型号：P2，P20，P200，P1000）
热循环仪（例如，Biometra，型号：T3000）。
NanoDrop（例如，Agilent Technologies，型号：Agilent 2100生物分析仪，目录号：G2939）
使用固定角转子（例如，Hitachi Koki，型号：T15A61）在室温下（RT）（例如，Hitachi Koki，型号：CT15E）微量离心。
用摆动转子（例如Eppendorf，型号：A-4-44）对50ml离心管（例如Eppendorf，型号：5804R） >
50毫升玻璃烧杯（Corning，PYREX®）。
通风橱
水族馆气泵（瑞纳水产供应，型号：301型）
玻璃板
小型杂交炉（Appligene，目录号：001050414）
Vortexer（，Baxter，产品目录号：S8223-1）
轨道振动筛（VWR）
37°C水浴
在4°C的冰箱
-20°C冷冻机
-80°C冷冻机
高压灭菌器
显微镜（蔡司，型号：Axioplan 2）

程序

PCR地高辛（DIG）标记的cDNA反义和对照（有义）探针的合成和纯化
1. 使用cDNA或在不存在内含子的情况下使用cDNA从靶基因（〜200bp）扩增选定的特定片段，基因组DNA作为基质，正向和反向引物各1μM，dNTP250μM和校正读数Pfu聚合酶。 br />
2. 如果获得单一条带，用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化PCR1片段，或用QIAquick凝胶提取试剂盒从凝胶中纯化条带，用10μl洗脱缓冲液洗脱并在凝胶上或使用NanoDrop定量。
3. 使用DIG标记的dUTP分别使用50-100ngPCR1,2μM正义或反义探针正向或反义探针DIG-dUTP / dNTP混合物（DIG DNA标记试剂盒）通过第二次PCR进行DIG标记步骤，。
4. 用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，并重悬于pH为8.0的10μlTE缓冲液中。
5. 为了质量控制，在琼脂糖凝胶上少量（1μl）标记探针（PCR2）。此外，在原位杂交（ISH）之前，可以使用斑点印迹来检测探针以分析灵敏度或RNA特异性的Northern印迹（Liao 。，2014）。
6. DIG标记的cDNA探针储存在-20°C。他们稳定了一年多。
第一天：从根部提取的预处理或寄生根结线虫（RKN）和ISH固定
1. 为了从受感染的根中提取寄生虫阶段，用自来水冲洗根部，将其切成约1厘米的棒。
2. 将根部浸入Pectinex®和Celluclast®混合物中，在室温下轻轻搅拌（定轨摇床，每分钟50转），将混合物孵育4小时（至过夜）。
3. 准备含有40毫升50％蔗糖/ M9的2个康宁管，并将它们储存在4°C的冰箱中。
4. 消化后，将液体倒入2.5毫米筛并收集滤液。
5. 将液体倒入250μm筛子并收集滤液。
6. 将液体倒入40μm筛子。
7. 采用最小量的自来水（〜8 ml）收集40μm筛上的寄生RKNs。
8. 通过蔗糖梯度离心纯化线虫：在冷的50％蔗糖/ M9混合物（2管）的顶部缓慢加入4ml所收集的线虫（图1）。
9. 在720℃下在4℃下离心5分钟，没有中断。
10. 用P1000收集线虫层，小心地将它们加入50ml玻璃烧杯中，加入40ml M9缓冲液（图1）。
  
  图1.通过蔗糖梯度提取寄生阶段
11. 要去除蔗糖，用50毫升M9，在10微米筛上，50毫升玻璃烧杯中洗两次，最后转移到50毫升康宁管中。
12. 收集的线虫处于寄生青少年的阶段2（J2），3（J3）或4（J4）或成年女性。新鲜孵化的RKN准选择性J2从蛋中获得，如Caillaud和Favery（2016）所述。
13. 在带有手套的通风橱中，在50ml Corning试管中重悬10 ml固定缓冲液中的线虫（10,000个J2s或至少50个寄生虫阶段）。
  固定持续过夜（16小时），准备阶段J2，寄生阶段48小时
第2天（或寄生阶段的第4天）ISH的线虫切割和透化
1. 用RNaseZap ®擦拭台式和移液器。
2. 用肥皂清洁玻璃板，用不含核酸酶的水冲洗，喷淋RNaseZap ，并用70％乙醇冲洗。
  用纸巾擦干
3. 缓慢减速离心含有线虫浸泡在固定缓冲液中的50ml试管，放置速度为1,620×g。
4. 取出固定缓冲液，但保持500μl并转移到1.5ml Eppendorf管中。
5. 在通风橱中，戴上手套，将线虫铺在玻璃板上，使用图2和视频1中所述的切割系统（振动水族箱泵+蒸压剃须刀片）将线虫切成两到三块。手中。在显微镜下检查切割的效率。切勿过多切割，尤其是寄生阶段。
  
  图2. ISH之前的线虫切割图（A）和实验装置（B）的图片。
  
  s视频1
6. 加入几滴不含1x RNase的PBS缓冲液以收集玻璃板上的线虫部分并转移到Eppendorf管中。
7. 旋下样品（15,000 em x g，1 min，缓慢减速）。删除缓冲区。
8. 悬浮于1ml无1x RNase的PBS中，然后以15,000xg g离心1分钟，缓慢减速。
  重复步骤C7和C8三次
9. 对于线虫透化，向线虫中加入1ml冷1mg / ml蛋白酶K溶液。将蛋白酶K保存在冷冻块中，不要漩涡。
10. 在旋转下（在杂交炉中）37°C孵育1小时。
11. 旋下样品（15,000 em x g，1 min，缓慢减速）。保持颗粒。
12. 将样品在1ml 1x PBS中洗涤并以15,000xg g离心1分钟并缓慢减速。保持颗粒。重复这一步三次。在最后一次洗涤中，尽可能多地去除1x PBS以获得干燥颗粒。
13. 将沉淀置于-80°C下15分钟
14. 加入1毫升冷甲醇（-80°C预冷）。
15. 漩涡以暂停线虫，并在室温放置2分钟。
16. 旋转样品（15,000 em x g，1 min，慢速减速）。
17. 去除甲醇。
18. 加入1 ml冷丙酮（预冷至-80°C）。
19. 将试管置于-80°C下15分钟。
20. 旋转样品（15,000 em x g，1 min，慢速减速）。
第2天（或第4天寄生阶段）:(原位杂交）
1. 将杂交炉的温度设置为50°C
2. 在50°C预热杂交缓冲液（HB）
3. 去除丙酮。
4. 在线虫颗粒上加入500μl预热HB
5. 旋下样品（15,000×g，1分钟，缓慢减速）并除去上清液。
6. 在线虫颗粒上加入500μl预热HB
7. 在50°C下在烤箱中旋转下孵育30分钟
8. 同时，将探针在100℃下变性5分钟（水浴）并立即转移到冰上（让温度迅速下降以防止再次退火）。将它们放在冰上3分钟。
9. 旋转样品（15,000 em x g，1 min，慢速减速）。
10. 将烤箱的温度设置为42°C。
11. 每个探针以100μlHB悬浮线虫（，例如，500μl用于5个探针）。
12. 将100μlHB分装到单个无核酸酶的试管中。
13. 每个探针添加5μl。
14. 在42°C（40-50°C，请参阅注意事项）下，在烘箱中搅动下进行杂交过夜。
第3天（或第5天寄生阶段）：洗涤和启示
1. 旋下样品（15,000 em x g，1 min，缓慢减速）。丢弃上清。
2. 用1ml洗涤缓冲液1（4x SSC，0.1％SDS）洗涤沉淀，在室温下旋转10分钟。
3. 旋下样品（15,000 em x g，1 min，缓慢减速）。丢弃上清。
4. 重复步骤E2和E3两次。
5. 用1ml洗涤缓冲液2（0.1x SSC，0.1％SDS）洗涤沉淀，在50℃旋转10分钟。
6. 旋下样品（15,000 em x g，1 min，缓慢减速）。丢弃上清。
7. 重复步骤E5和E6两次
8. 旋下样品（15,000 em x g，1 min，缓慢减速）。弃上清。
9. 用1ml过滤的马来酸缓冲液（1x）洗30秒。
10. 旋下样品（15,000 em x g，1 min，缓慢减速）。丢弃上清。
11. 在37℃孵育线虫30分钟（烤箱）在1毫升的1倍勃林格封闭试剂（见食谱）。
12. 在1ml Boehringer封闭剂中加入1ml与碱性磷酸酶（1：500）偶联的抗DIG抗体，37℃孵育线虫3小时。
13. 旋下样品（15,000 em x g，1 min，缓慢减速）。丢弃上清。
14. 每次用1ml 1x过滤马来酸缓冲液在37℃洗涤三次，每次15分钟
15. 用1 ml碱性磷酸酶检测缓冲液（APB）简单冲洗。
16. 通过将线虫在室温下在1ml APB +3.75μlBCIP +5μlNBT中温育6至8小时而没有搅动显示信号。
17. 把一滴放在显微镜载玻片上，加一个盖玻片。
18. 在显微镜下观察（Axioplan2,10倍物镜）。
19. 如果没有检测到信号，继续在4°C孵育过夜。
20. 用无核酸酶的水清洗线虫
21. 把一滴放在显微镜载玻片上，加一个盖玻片。
22. 在显微镜和图像线虫下观察

数据分析

用微分干涉对比显微镜检查线虫。观察到的信号应该与使用控制检测探针（阴性对照）获得的图像进行比较（图3）。应该增加一个积极的控制。我们通常使用编码在两个亚腹侧腺体中表达的多聚半乳糖醛酸酶的MiPG基因（Jaubert et al。，2002a）。我们建议拍摄至少40条染色的线虫，分析检测到的RNA斑点的细胞定位，并计算染色的线虫数量。每个ISH实验应该独立复制。 ISH可以在siRNA基因沉默靶基因之后进行以确保特异性和/或评估沉默效应。此外，使用不同探针组杂交相同靶基因的对照实验可以完成以确保探针对靶基因的特异性。

图3. M的组织表达。 incognita EFFECTOR1 （ MiEFF1 ）在准备性J2和寄生青少年中的应用。 A-B。来自 MiEFF1 的成绩单（ Minc17998 ）位于准备性J2s的唾液背腺（箭头）。 C.感应MiEFF1对照探针不产生线虫组织的标记。 2012年，Jaouannet等人发表了一项寄生青少年的MiEFF1组织表达。比例尺= 50μm。

笔记

对于线虫净化和固定，请在使用前立即制备新鲜溶液。
准备两个含有40毫升50％蔗糖/ M9的康宁管，并将它们存放在4°C的冰箱中。
对于ISH，戴上手套。所有的解决方案都是无RNAse的，不要直接吸入主解决方案。
所有使用固定剂和杂交缓冲液进行的实验都应在通风橱中进行。
使用剃刀刀片时要非常小心
第1天在-80°C下放置甲醇和丙酮的等分试样，以用于第二天的线虫透化步骤。
对于线虫透化，不要涡旋蛋白酶K并将其保存在冷冻块中。
可以调整杂交温度以获得信号特异性和数量之间的最佳平衡。
地高辛（DIG）标记的RNA探针可以用来代替cDNA探针，如Rosso等人（1999）所述。
使用无核酸酶，而不是DEPC处理过的水。
对于启示，辣根过氧化物酶（HRP）可用于替代碱性磷酸酶（AP）。我们选择AP是因为来自AP底物的信号随时间逐渐增加，非常稳定并且可以持续数天。

食谱

提取线虫

Pectinex ®和Celluclast® mix
15毫升Celluclast
30毫升Pectinex®

点击H 2 O至200毫升
M9缓冲区
42.3mM Na 2 HPO 4 4/2 22 mM KH 2 PO 4 4/2 85.6 mM NaCl
1mM MgSO 4·7H 2 O
M9中50％蔗糖
50克蔗糖
M9缓冲液可达100毫升
无RNase 1x PBS
1毫升10x PBS
9毫升无核酸酶蒸馏水

用于探针，固定和杂交，无核酸酶

固定缓冲液
1毫升37％甲醛溶液
1个PBS最多10毫升
备注：
1. 在通风橱下准备和操作。
2. 如果将37％的甲醛溶液在4℃下储存，在打开之前将其温热至RT。
1毫克/毫升蛋白酶K溶液
1毫升蛋白酶K溶液（20毫克/毫升）
1x PBS最多20 ml
来自贝克酵母的tRNA

在1毫升无核酸酶的水中溶解500U酵母tRNA 分装并储存在-80°C。
杂交缓冲液（HB）
注意：在通风橱下进行准备和操作，并保存在-20°C。
5 ml去离子甲酰胺（99.5％，4°C）
0.5ml SSC缓冲液（20x，RT）
1 ml Boehringer封闭剂（10％，4°C）
2ml SDS（10％，RT）
200μlDenhart's溶液（50x，-20°C）
20μlEDTA pH 8（0.5M，RT）
200μl鲑鱼精子DNA（10 mg /μl，-20°C）

来自Baker's酵母的62μltRNA（500 U / ml，-80°C）无核酸酶水可达10毫升
洗涤缓冲液1（4x SSC + 0.1％SDS）
400μlSSC缓冲液（20x，RT）
20μlSDS（10％，RT）
不含核酸酶的水可达2毫升
洗涤缓冲液2（0.1x SSC + 0.1％SDS）
10μlSSC缓冲液（20x，RT）
20μlSDS（10％，RT）
不含核酸酶的水可达2毫升
10％勃林格封闭剂
1克阻塞试剂粉末在一个瓶子里
过滤马来酸缓冲液，pH值7.5至10毫升

高压灭菌器在4°C溶解并储存
12.过滤的马来酸缓冲液，pH 7.5

11.61 g马来酸（100 mM） 8.76克NaCl（150毫摩尔）
用NaOH调节pH至7.5
高压灭菌器，过滤并在RT
存放
Tris-HCl 2M，pH 9.5
1. 溶解121.1克Tris-碱于400毫升去离子水中
2. 通过加入浓HCl来调节pH值至所需值
3. 在对pH进行最终调整之前，让溶液冷却至室温
4. 用去离子水调整溶液的体积至500毫升
5. 分装成50毫升等分试样并通过高压灭菌法灭菌
碱性磷酸酶检测缓冲液pH 9.5（APB）
50 ml Tris-HCl 2 M pH 9.5（终浓度100 mM）
5.85g NaCl（最终100mM）
10.17克MgCl 2·7H 2 O（50mM最终）
不含核酸酶的水可达1升

分装，高压灭菌并在室温下储存

致谢

该协议已从de Boer等人改编而来。（1998）和Rosso et al。（1999）。它使得研究几十种基因的表达谱成为可能（Jaubert等人，2002a和2002b; Neveu等人，2003; Jaubert等人， 2004; Ledger等人，2006; Dubreuil等人，2007; Jaouannet等人，，，< 2012; Jaouannet et al。，2013; Danchin et al。，2013; Nguyen et al。，2017）。这些作品由INRA，CNRS，尼斯大学Sophia Antipolis，普罗旺斯 - 阿尔卑斯 - 蓝色海岸地区，法国政府，欧盟和北约合作研究资助资助。 C-N，N-。得到了越南社会主义共和国教育和培训部的USTH奖学金，911-USTH计划的支持。作者没有利益冲突或竞争利益声明。

参考

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Jaouannet，M.，Perfus-Barbeoch，L.，Deleury，E.，Magliano，M.，Engler，G.，Vieira，P.，Danchin，EG，Da Rocha，M.，Coquillard，P.，Abad，P 。和Rosso，MN（2012）。将根结线虫分泌蛋白注入巨细胞并靶向细胞核。 a> New Phytol 194（4）：924-931。
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