材料和试剂

塑料巴斯德移液器：
3毫升（P-3）和2毫升（P-1）（金牛座生物医学）
1.5毫升移液器（RPI，目录号：147500）
注：从今以后，这些都将被称为'移液器'。获得正确尺寸的移液管并将轴切割至正确的孔径尺寸（见图1）是操作大脑，半球和外植体而不损坏它们的关键。

图1.塑料巴斯德移液器。：一种。在此过程中使用不同大小的移液管：＃1（1.5毫升移液管），＃2（2毫升移液管），＃3（3毫升移液管），如图所示切割＃4。切割仅在移液管轴直径开始渐缩的位置进行，距离尖端约2 cm。 B.用移液器在酒精中消毒的烧杯。
35毫米无菌培养皿（Laxbro，目录号：PD-35 TC）
细胞培养6孔组织培养板（Thermo Fisher Scientific，目录号：140675）
微管尖端
玻璃毛细管：不含细丝的薄壁硼硅管（Sutter Instruments，目录号：B100-75-10）
100毫米培养皿（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：150464）
无菌刀片
细胞培养插入物：0.4μm（Millicell，Merck，目录号：PICM03050）
吸气器组件（Sigma-Aldrich，目录号：A5177-5EA）
带有0.22μm过滤器（Millex-GP，Merck，目录号：SLGP033RS）的50 ml注射器过滤器单元用于对培养基进行灭菌
2喷瓶（Tarsons，目录号：561100）（含70％和100％乙醇）
pCS2-EGFP质粒（或任何所需的质粒）
怀孕的瑞士小鼠（SWR / J）（从塔塔基础研究所繁殖设施获得）
无水乙醇（Merck，目录号：107017）
Leibovitz的L-15培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：41300039）
快速绿色染料（西格玛奥德里奇，目录号：F7252）
青霉素 - 链霉素（P / S）（10,000U / ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
Dulbecco改良的Eagle培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：12800017）
B27 TM补充物（50x），无血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：17504044）
DMEM培养基的工作溶液（请参阅食谱）

设备

水平流罩（Kirloskar，Envair Electrodyne，目录号：KCH-B）
玻璃烧杯（Borosil，产品目录号：1000D21）
组织切碎机（McIlwain，型号：MTC / 2E）
立体显微镜（奥林巴斯，目录号：SZ61）置于水平流动组织培养罩
细胞培养孵育器（Thermo Fisher Scientific，型号：Heracell TM 150）
操纵胚胎大脑的精细工具：
1. Dumont＃5镊子，Dumostar（Roboz手术器械，目录号：RS-4978）
2. Dumont＃55，镊子，Dumostar（Roboz手术器械，目录号：RS-4984）
3. 微解剖弹簧剪刀（Roboz手术器械，目录号：RS-5603）
用于处理斩波器光盘的粗镊子（Roboz手术器械，产品目录号：RS-5040）
用于打开大坝和去除子宫的精细剪刀（Fine Science Tools，目录号：14060-11）和组织钳（Roboz Surgical Instrument，目录号：RS-8166）
电极（3毫米，BTX，哈佛设备，目录号：450487）
Electroporator（BTX，Harvard Apparatus，型号：ECM 830）
双级玻璃微管拉拔器（NARISHIGE，型号：PC-10）

程序

道德声明：所有程序都遵循Tata基础研究机构动物伦理委员会指导原则。

设置（预备）
注意：收获胚胎后的所有步骤均在水平流罩中进行。
1. 用70％乙醇擦拭组织培养罩的表面。
2. 将70％的乙醇倒入200毫升的玻璃烧杯中，通过将乙醇一直吸入灯泡然后将其排出来对＃1，＃2和＃3移液器进行消毒。让剩余的乙醇排出。
3. 用L-15培养基清洗移液管以去除痕量的乙醇，并保持站立在解剖显微镜附近的无菌空烧杯中，以便于接近。
4. 将解剖器械置于含有70％乙醇的塑料托盘中10分钟，然后在使用前擦干。
  在无菌托盘中放置，以便在操作过程中轻松进入
5. 将大约六个35毫米的培养皿放在冰上填充L-15。
6. 在需要数量的6孔组织培养板的孔中加入1.25ml的DMEM培养基。使用无菌镊子每孔放置一个无菌细胞培养插入物。将6孔板转移至37°C培养箱以预热培养基。通常，取决于胚胎阶段，5-8个器官型外植体可以容纳在一个细胞培养插入物上。
准备注射
1. 在无核酸酶的水中准备2μg/μl的pCS2-EGFP质粒（或任何所需的质粒）。用微量吸头轻轻触摸一些快速的绿色染料，并将其引入DNA溶液中并混合。这样可以在注射期间和注射后观察DNA溶液。
2. 为了准备玻璃毛细管，将毛细管拉拔器设置在62.5°C的温度下进行一步拉伸。
3. 使用拉拔器拉动毛细管，并将它们放置在毛细管支架上的培养皿中。
4. 将毛细管安装在吸嘴上吸取橡皮吸管，并吸取约5-10μl含有快速绿色染料的DNA溶液。这将持续大约2-3次体内注射。
收获胚胎
1. 使用贵研究所许可的程序牺牲期望阶段的孕坝（E13.5-18.5）。下面显示的示例是瑞士鼠标的E15.5。在C57BL / 6J背景下的Nfia突变体胚胎也已成功用于2011年的Subramanian等人。，
2. 用乙醇擦拭腹部皮肤，并做一个纵向切口。用70％乙醇（喷瓶）清洁切口区域，并使用一副新的无菌镊子和剪刀在腹壁上切开一个切口。
3. 注意不要接触大坝的皮肤或头发，一个接一个地提起子宫的每个手臂。在最低点切下子宫并转移到含有无菌PBS的培养皿中。从这一点开始，所有程序都将在组织培养罩内进行。
4. 使用解剖显微镜仔细地从子宫中取出胚胎，并将它们放入含有无菌1x PBS的无菌100mm培养皿中。
5. 斩首胚胎并将头转移到含有L-15的新鲜无菌培养皿中。
6. 解剖大脑并使用移液管＃3将其转移至含有保存在冰上的L-15的35mm培养皿。去除大脑后，切断后脑和中脑，只保留包括嗅球在内的前脑。嗅球的存在有助于将远端半球以正确的方向放置在组织切碎器板上。只有在电击后才能保留和移除脑膜。
注：多次转移（步骤C4-C6）到含有无菌PBS / L-15的新鲜培养皿中，有助于清除任何可能的污染并保持无菌状态。
电穿孔和器官切片制备
图2显示了总体程序的总结漫画，以及培养期结束时的样本器官外植体。

图2.体外电穿孔和器官切片制备的总结示意图A.注射DNA和完整脑电穿孔; B.含有电穿孔祖细胞的切片（绿色圆圈）; C.在体外6天后，外植体显示存在于锥体细胞层（黄色）内的表达GFP的锥体神经元（绿色三角形）。这些神经元最初延伸轴突（绿色），朝向发育中的毛细胞（箭头）生长，然后环绕外植体的外围，可能是因为它们不能将毛细管离开过滤器。 D.一种器官外植体的图像，显示轴突束生长到菌毛中，然后在外植体周围（箭头）。比例尺=100μm。该图和图例从图5 Subramanian et al。，PNAS，2011年进行了修改。
1. 将组织切碎机设置为250μm，并将无菌刀片插入刀片。拧紧刀片。
  使用喷射瓶将100％乙醇冲洗在刀片上并让设备干燥。
2. 用乙醇擦拭桨叶电极并将它们连接到electroporator。
3. 将参数设置为以下内容：电压50 V;时间50毫秒;脉冲数5;脉冲间隔999毫秒。
4. 如图3A所示，将半球的心室注入所需的DNA溶液（与Fast Green混合）电穿孔。心室是中空的，可以通过其较暗的外观来识别，并且当微量吸管刺穿神经上皮并进入心室时阻力减小。建议进行单侧注射和电穿孔，然而，染料-DNA溶液有时可能扩散到连接的对侧脑室（见图3B）。这是正常的，不影响实验设置。用溶液填充侧脑室，直到染料显示心室腔被填充（见图3B）。取决于使用的胚胎的年龄，可以将大约5-10μl的溶液注入心室。由于DNA注入心室，最容易进入DNA的细胞是心室区细胞，其由分裂的神经元祖细胞组成。这是电穿孔的主要人群（Saito，2006）。
  
  图3.注射DNA溶液到远端脑半球和电穿孔。A.玻璃毛细管（箭头）将DNA注入心室腔。 B.桨叶电极（正极和负极）以适合于电穿孔海马的角度定位。（ *在图3B中，负电极的绝缘物在尖端被削去，所以一部分桨叶呈现银色，这不影响电穿孔。）比例尺=500μm。 />
5. 立即进行电击，使DNA溶液不会扩散到心室外。将电极放置在图3B所示的角度，使正极位于对侧，负极位于半球的同侧以进行电穿孔。由于DNA带负电荷，它会向正电极移动，因此在半球的内侧显示最大的电穿孔。
6. 启动electroporator上的脉冲序列。电穿孔区域周围的桨叶下面的气泡指示电流成功通过。（ - ）桨式电极下通常会出现更多气泡。
7. 将电穿孔的大脑转移到含有冰冷的L-15培养基的35mm培养皿中。保持冰5分钟。与此同时，根据实验要求电穿孔其他大脑。将每只大脑转移到冰冷的L-15上。
8. 一旦所有需要的大脑都被电穿孔，分离电穿孔的半球并仔细去除脑膜。
9. 将半球放置在组织切碎器上，使得内侧面与台上的白色圆盘接触，并且侧面（新皮层）面朝上。使用移液器＃1轻轻地移除多余的培养基。过量的介质会导致半球在下一步（切碎）中摆动。在吸取多余的培养基的同时，使半球的尾轴与叶片正交，以便获得冠状切片（嗅球需要指向右或左，而不是朝向或远离你，如图4所示）。
  
  图4.将解剖的电穿孔半球放置在组织切碎器的台上。请注意，将砧板光盘固定在位的弹簧夹应朝向R-L方向，以防止它们与刀片发生干涉。
  
  头脑半球的方向应该被考虑在内（嗅球指向R或L）。
10. 开始斩波（视频1和2）。立即用两对强力钳取出夹持切碎组织的圆盘。将组织放入含有冷L-15（视频3）的清洁含L-15的碟中。
  
  s视频1
  
  s视频2
  
  s视频3
11. 半球看起来像一块切片面包（图5A）。翻转半球，使内侧面朝上。轻轻地刺激以从内侧释放指状突起，其是海马的单个切片。使用精细的镊子从新皮层切断海马（虚线，图5A）。在含有冰冷的L-15培养基的新鲜35毫米培养皿中收集海马切片。
  
  图5.从切碎的半球中分离器官型海马切片。：一种。显示“切片面包”外观的切碎半球的图像。 B.从切碎的半球分离出单个海马外植体。 C.（B）中的相同外植体重新定向并标记。 CA1，CA3，海马田地。 DG，齿状回。比例尺= 500微米。
12. 从培养箱中取出含有细胞培养插入物的6孔培养皿并置于解剖显微镜下（图6）。
  
  图6.具有细胞培养插入物的6孔组织培养皿
13. 使用移液管＃2吸取5-6个海马外植体与一些L-15培养基。通过轻轻地向移液管的球管施加压力，将外植体逐个放到滤盘上，以便只分配一个外植体，每个都在其自身的L-15培养基液滴中（图7A）。使用移液管＃1轻轻吸出多余的培养基，并使用吸液产生的流体流动轻轻定位外植体，使它们互不接触，也不会粘在细胞培养插入物的壁上（图7B）。应该有足够的培养基来防止外植体变干，但应避免使用过量的培养基，以防止外植体折叠或漂浮（图7C和7D）。外植体不会干燥;他们可以通过过滤器访问井中的DMEM培养基。
  
  图7.将海马外植体置于培养插件上。：一种。使用移液管＃2将外植体置于单独的培养基液滴上。 B.使用移液器＃1移除多余的液体。在这个步骤中，可以分离两个可能已经沉积在相同液滴中的外植体（C）。 D.程序完成时外植体的图像。
14. 在37℃，5％CO 2下孵育海马外植体。每隔一天更换媒体。
15. 几个小时内，如果使用荧光报告基因构建物，电穿孔可以被显现。在接下来的3-5天内，标记的祖细胞分化成锥体神经元，将顶端过程延伸至卷曲外植体的中心，并且轴突沿着外植体到达伞形区域（图8）。
  
  图8.在连续的天内在体外成像的单个器官型海马体外植体 A.在体外1天后（DIV），电穿孔的细胞是看到靠近心室区（黄色虚线）。顶端过程看起来延伸到外植体箭头的中心）。（B）和（C）在体外进行额外的天时，细胞开始从体内迁移离开心室区（黄色箭头）并形成金字塔形细胞层。 D.通过体外6天，电穿孔的细胞延伸轴突（白色箭头），可以看到围绕外植体。（A-D）中的图像是由多个拼接在一起的帧组成的复合物。比例尺= 100微米。

数据分析

这种体外电穿孔的海马器官制剂可用于评估神经元或神经胶质是否由祖细胞产生。在伞毛中存在表达GFP的轴突是神经发生的指示。参见Subramanian等人（2011），图5，用神经原或神经胶质细胞构建体电穿孔的外植体图像。这些外植体也可以针对细胞类型特异性标记进行免疫染色并根据需要分析兴奋性/抑制性神经元或神经胶质的分布。

笔记

重现性和可变性：电穿孔的程度是可变的，但可以通过练习使其更加可重复。需要注意的关键问题是电极的角度以及人们是如何小心地控制大脑即组织与桨叶电极的接触。
在电穿孔过程中，大脑需要完全浸没在培养基中。
技术提示和注意事项：
1. 生产外植体的速度对外植体健康至关重要。
  。当组织不在显微镜或切碎阶段时，将组织保存在冰冷的L-15上很关键。
2. 能够在切碎的大脑中识别“良好”的海马状指状突起也伴随着练习。通常，在切碎的脑的尾端可以看到易于识别的海马形态，而从更多内侧位置制备的外植体只能通过微小的菌毛识别。一个很好的经验法则是，如果它没有一个伞，它可能不是一个海马外植体，而是一个弯曲的新皮层伪装成一个海马。
3. 细胞培养插入物最适合于6孔板。不要尝试使用单个35毫米的碟子 - 它们没有必要的高度。这道菜不能正常关闭，所以介质会干燥或被污染。

食谱

DMEM培养基的工作溶液（50毫升）
B27：500微升
青霉素 - 链霉素：500μl的100x股票
DMEM：49毫升
使用0.22μm过滤器过滤灭菌，并在4°C下保存。按照B27
文档手册中的建议，使用此解决方案长达1周

致谢

我们感谢Leora D'Souza协助录像，S。Suryavanshi博士和TIFR动物繁殖设施提供出色的支持。该协议是在Tole实验室利用来自Wellcome Trust高级研究员（056684 / Z / 99 / Z），Swarnajayanti研究员（4/3/2005-SF）的支持，印度政府生物技术部的赠款和从TIFR-DAE到ST的校内资金;来自TIFR捐赠基金的Kanwal Rekhi职业发展奖给LS。 ST是Shanti Swarup Bhatnagar奖（印度政府科学与工业研究委员会）和Infosys生命科学奖（Infosys科学基金会）的获得者。
该方案用于Subramanian等人（2011）Proc Natl Acad Sci U S A 108（27）：E265-274。（现在的地址：Eli＆amp; Edythe Broad Center of Regeneration Medicine＆amp; Stem Cell Research，University of California San Francisco，CA 94143，USA）。
作者没有利益冲突或利益冲突。

参考

Opitz-Araya，X.和Barria，A。（2011）。器官型海马切片培养。 Exp Exp （48 ）。
Saito，T.（2006）。体内电穿孔胚胎鼠中枢神经系统 Nature Protoc 1（3）：1552-1558。
Stoppini，L.，Buchs，P.A。和Muller，D。（1991）。一种用于神经组织器官培养的简单方法 Neurosci Methods < 37（2）：173-182。
Subramanian，L.，Sarkar，A.，Shetty，AS，Muralidharan，B.，Padmanabhan，H.，Piper，M.，Monuki，ES，Bach，I.，Gronostajski，RM，Richards，LJ和Tole，S. （2011年）。转录因子Lhx2对于抑制星形胶质细胞生成和促进发育中海马的神经发生是必要和充分的。美国国立科学院美国科学院 108（27）：E265-274。
Tole，S.，Christian，C.和Grove，E.A。（1997）。早期规范和自主开发小鼠海马皮质区域开发 124（24）：4959-4970。