材料和试剂

分离人基因组DNA克隆小基因
1. 1.5 ml Eppendorf管（SARSTEDT，目录号：72.690.001）
2. 手术刀（斯旺莫顿，目录号：0510）
3. Gentra Puregene口腔细胞试剂盒（QIAGEN，目录号：158845）
4. 2-丙醇（100％，ACS，ISO，Reag。Ph.Eur。等级）
5. 乙醇（70％，ACS，ISO，Reag。Ph.Eur。等级）
重叠延伸PCR用于构建和克隆小基因
1. PCR管（品牌，目录号：781320和781334）
2. 选择的表达载体（例如，，pcDNA3.1载体（+），Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：V79020）
3. 双蒸H 2 O（ddH 2 O）
4. Herculase II融合DNA聚合酶（Agilent Technologies，目录号：600675）
5. dNTPs，10mM（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：R0192）
6. DNA加载染料（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：R0611）
7. GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：SM1331）
8. EDTA（VWR，目录号：20302.293）
9. 三（羟甲基）氨基甲烷（VWR，目录号：103156X）
10. 硼酸（VWR，目录号：20185.360）
11. QIAquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28704）
12. 1x TBE缓冲液（见食谱）
定点诱变以将感兴趣的点突变引入小基因
1. PCR管（品牌，目录号：781320和781334）
2. QuikChange Lightning定点诱变试剂盒（Agilent Technologies，产品目录号：210518）
3. 双蒸H 2 O（ddH 2 O）
4. 蛋白胨（Applichem，目录号：403898.1210）
5. 酵母提取物（Applichem，目录号：A1552）
6. NaCl（VWR，目录号：27810.364）
7. D - （+） - 葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：49159）
8. 琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A5054）
9. 适用于质粒载体的抗生素（例如，氨苄青霉素，卡尔罗斯，目录号：K029.2）
10. 含有用于质粒载体的合适抗生素的LB琼脂平板（参见食谱）
11. LB培养基（见食谱）
将小基因亚克隆到rAAV载体中
1. 适当的rAAV载体质粒（如emA，pAAV-MCS2，Addgene，目录号：46954）

设备

移液器（如，Eppendorf）
Vortexer（Heidolph Instruments，型号：Reax top）
培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Heraeus B12 Function Line，目录号：50042307）
微量离心机（Eppendorf，型号：Centrifuge MiniSpin ，目录号：5452000018）
两个水浴（Haake，目录号：003-2859）
热循环仪（Thermo Fisher Scientific，型号：ProFlex TM，目录号：4483636）
NanoDrop TM（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：ND-2000C）

软件

人类拼接发现软件（ eg ， http://www.umd.be/HSF3/ ）
计算器软件（例如，NEB T m 计算器）

程序

电脑模拟拼接分析
在很多情况下，初步预测单个突变的mRNA剪接可能是有帮助的。为了预测对感兴趣突变的剪接的潜在影响，可以使用人类剪接发现软件（， http://www.umd.be/HSF3/ ）。
1. 转到 http://www.umd.be/HSF3/ 并选择分析类型。我们建议使用“分析序列”选项。
2. 选择一个序列。我们建议使用“粘贴自己的序列”选项。将感兴趣的序列的野生型版本粘贴到提供的框中，然后点击“继续分析”。
  注意：您的序列应在两侧各自的点突变的侧翼至少包含40 bp。
3. 点击'执行快速突变'，输入您感兴趣的突变相对于之前输入的序列的位置并选择新的核苷酸。然后点击“继续快速突变分析”。
4. 人类接头查找器网络服务器输出：
  1. 点击'原始数据表'来详细分析输入的点突变的影响。
  2. 为您提供了五个不同的数据表，称为“潜在剪接位点”，“潜在分支点”，“增强子图案”，“消声器图案”和“其他剪接图案”。它们中的每一个都显示由点突变引起的百分比变化。新形成的剪接位点或图案用绿色表示，现有位置或图案的强度变化用浅黄色表示。
5. 对所有感兴趣的点突变重复进行分析，并选择预测影响剪接的基因以进一步克隆。
分离人基因组DNA克隆小基因
1. 将一个水浴预热至65°C，另一个预热至37°C
2. 为了收集颊细胞，用Buccal Collection Brush（在试剂盒，材料和试剂A3中提供）刮擦口腔内部10次。
  注意：为获得最佳效果，在进食或饮水后至少等待1小时以收集颊细胞。
3. 将300μl细胞裂解溶液（在试剂盒中提供，材料和试剂A3）分配到1.5ml Eppendorf管中。
  使用无菌手术刀从手柄上取下收集刷，并将分离的头放入管中。
4. 在65°C孵育60分钟以完成细胞裂解。
5. 从细胞溶解液中取出收集刷头，在管侧刮取尽可能多的液体。
6. 加入1.5μlRNase A Solution（试剂盒中提供），并将试管翻转25次。
7. 37°C孵育30分钟。在冰上孵育1分钟以冷却样品。
8. 加入100μl蛋白质沉淀溶液（在试剂盒中提供，材料和试剂A3），高速涡流剧烈搅拌20秒。
9. 在冰上孵育5分钟
10. 在13,000-16,000×g的条件下离心3分钟沉淀沉淀的蛋白质。
11. 吸取300μl异丙醇和0.5μl糖原溶液（在试剂盒中提供，材料和试剂A3）到一个干净的1.5ml Eppendorf管中，并且通过倾倒或小心移液加入上一步的上清液。确保不要转移蛋白质颗粒。
12. 轻轻翻转试管50次或以20rpm旋转2.5分钟混合。
13. 在RT下离心5分钟，13,000-16,000×g 。
14. 小心丢弃上清液，并将管倒置在一块干净的吸水纸上，注意将颗粒留在管中。
15. 加入300μl的70％乙醇，反转几次，洗涤DNA沉淀。
16. 在RT下离心1分钟，13,000-16,000×g 。
17. 小心丢弃上清液。将管子放在一张干净的吸水纸上，注意颗粒留在管中。允许风干5分钟。
18. 加入100μlDNA水合溶液（在试剂盒中提供，材料和试剂A3），并以中等速度涡旋5秒以混合。
19. 在65°C孵育1小时以溶解DNA。
20. 在室温下温和振荡孵育过夜。确保管帽紧闭以避免泄漏。然后将样品短暂离心并转移到储存管中。

重叠延伸PCR用于构建和克隆小基因
的 C1。重叠引物的方法描述和设计
为了使基于小基因的mRNA拼接突变分析能够缩短大内含子。在我们最近的研究中，我们验证了约。 200bp的外显子区域位于外显子侧翼足以进行正确的mRNA剪接（Becirovic等人，2016b; Nguyen等人，2016）。
为了通过标准克隆程序产生合适的小基因，可以使用重叠延伸PCR。为此，作为第一步，必须通过标准PCR扩增各自的外显子，包括≥200bp的侧翼内含子。用于此PCRs的引物必须包含约定义的突出端。 20 bp。这些突出端与待在第二重叠延伸PCR中连接的相应PCR片段互补。这些产生了用于扩增两个片段的〜40bp重叠区。我们将这一策略应用于创建包含三个本地外显子的小基因，其中包括两个缩短的侧翼内含子（图2）。然而，这种方法也适用于具有随机数目的外显子和缩短的内含子的小基因的产生。

设计PCR引物以扩增一个外显子加上≥200bp的侧翼内含子区域。使用T计算器软件（例如，NEB T计算器）检查熔化温度（Tm / 2）。
为了创建重叠区域，引物必须包含约。与邻接的PCR扩增子互补的20bp长的区域（见图2）。
例如：当设计引物扩增第二外显子加侧翼内含子区域（扩增子＃2）时，将含有外显子1的扩增子（扩增子＃1）中最后20 bp的序列添加到正向引物的5'末端。接下来，将含有外显子3的第一个20bp的扩增子（扩增子＃3）的反向序列添加到反向引物的5'末端。这些重叠序列对于后续重叠延伸PCR将是必需的。

图2.重叠延伸PCR的示意图，用于创建包含三个外显子和两个缩短的侧翼内含子的小基因。单个扩增子以不同的颜色显示。限制网站显示为蓝色。引物根据它们的模板和匹配的重叠被描述为双色。来自步骤1的两个PCR扩增子用作重叠PCR1的模板，并且可以以随机方式（例如，PCR1 + PCR2的扩增子）组合在一起。最后的重叠PCR 2可以用剩余的PCR片段（在本例中为PCR 3的扩增子）进行。对于所有重叠PCR，只应使用第二个PCR扩增子的第一个和第三个引物的5'引物。
对于第一个小基因外显子的扩增：根据您的表达载体的限制性位点（例如， Hind ）添加适当的限制性位点到正向引物的5' III在pcDNA3.1中）。考虑在限制性酶切位点的5'末端添加一个额外的序列（最多4 bp），以便通过限制酶进行更有效的切割。
对于最后一个小基因外显子的扩增：根据您的表达载体的限制性位点（例如， Not I ）。考虑在限制性酶切位点的5'末端添加高达4 bp的限制性内切酶进行更有效的切割。
从商业供应商（例如Eurofins Genomics）订购PCR引物（大约0.05μmol，至少HPSF纯化的）。

的 C2。 PCR扩增全长外显子和缩短内含子

为了扩增单个外显子和侧翼内含子区域，按如下方法制备样品反应：

X µl	Genomic DNA (100-300 ng)
5 µl	5x Herculase II Fusion buffer*
1 µl	dNTPs (10 mM)
1 µl	Forward primer (10 µM)
1 µl	Reverse primer (10 µM)
0.25 µl	Herculase II Fusion DNA Polymerase*
Add to 25 µl	Double distilled H2O

*注意：在试剂盒中提供（材料和试剂B4）。

上下移液，将所有试剂混合在PCR管中
对于PCR，使用以下循环参数：

注：为获得最佳效果，退火温度可根据需要进行调整。
扩增后，加入5μl6x DNA Loading Dye到您的PCR反应中，加入0.7％琼脂糖凝胶以及您选择的DNA标准品（例如GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder）并运行它在1x TBE缓冲液中。检查正确的放大。
如果扩增成功，即如果你看到一个正确大小的条带，用一把手术刀切除它，然后将凝胶片放入Eppendorf管中。
根据制造商的说明使用凝胶提取试剂盒纯化DNA
使用NanoDrop测量DNA浓度。
对所有外显子重复步骤C2。

的 C3。重叠延伸PCR

要加入包含外显子1和2的前两个扩增子，请按以下步骤准备样品反应：

X µl	Amplicon #1 (100-150 ng)
X µl	Amplicon #2 (use molar ratio 1:1)
5 µl	5x Herculase II Fusion buffer
1 µl	dNTPs (10 mM)
1 µl	Forward primer of Amplicon #1 (10 µM)
1 µl	Reverse primer of Amplicon #2 (10 µM)
0.25 µl	Herculase II Fusion DNA Polymerase
Add to 25 µl	Double distilled H2O

上下移液，将所有试剂混合在PCR管中
对于PCR，使用以下循环参数：

注：为获得最佳效果，可根据需要调整退火温度。
将所有的PCR反应加载到琼脂糖凝胶上并检查扩增是否正确。
如果扩增成功，即如果您看到正确大小的条带，请根据制造商的说明使用凝胶提取试剂盒切下条带并纯化DNA。
使用NanoDrop测量DNA浓度。
重复重叠延伸PCR 以连接新的扩增子和随后的扩增子。为此，使用两种扩增子的纯化DNA作为模板;并且扩增子＃1的正向引物和扩增子＃3的反向引物作为重叠延伸PCR引物。
根据要连接在一起的扩增子的数量，可以重复步骤1-7。
使用标准克隆技术，使用选定的限制性位点将您的小基因克隆到相应的表达载体中。
通过测序（例如，Eurofins Genomics）检查小基因的正确序列。
注意：
1. 考虑在小基因的5'或3'末端使用携带报道基因（例如GFP）的表达载体。如果小基因也将用于蛋白质分析，这将使得蛋白质表达的方便可视化成为可能。
  
  检查正确的阅读框，并在进行下一步之前，通过测序在适当的位置存在起始密码子和终止密码子。
2. 该载体对于小基因表达的初始体外测试和mRNA剪接的验证是必需的。在此阶段不要使用rAAV载体进行克隆，因为rAAV载体ITRs的二级结构会阻止定点诱变（参见下节）。

定点诱变将感兴趣的点突变导入小基因
的 D1。诱变寡核苷酸引物的设计

使用 QuikChange引物设计程序并选择您需要的QuikChange试剂盒（ eg ，QuikChange Lightning）。
将您感兴趣的基因的DNA序列粘贴到框中，然后点击“立即上传”。
要生成点突变，请通过勾选相应的框来选择要更改的核苷酸。随后，选择“Site 1”框中的替代核苷酸。
点击'设计入门'。
获得正向和反向引物的顺序以及附加信息（例如，长度，T m ）。
从商业供应商（例如，Eurofins Genomics）订购引物。
注意：
1. 期望的突变应位于两侧引物的中间，两侧各有10至15 bp的正确序列。
2. 它们的长度应该在25到45 bp之间。
3. m ≥78°C（由Tm计算器验证，例如NEB）

的 D2。突变链合成反应

准备样品反应如下：

5 µl	10x QuikChange Lightning Buffer*
X µl	10-100 ng of dsDNA template
X µl	125 ng of forward primer
X µl	125 ng of reverse primer
1 µl	dNTP mix*
1.5 µl	QuickSolution reagent*
1 µl	QuickChange Lightning Enzyme*
Add to 50 µl	Double distilled H2O

注意：

*在试剂盒中提供（材料和试剂C2）。
我们推荐10-30 ng双链DNA模板。

上下移液，将所有试剂混合在PCR管中
对于PCR使用以下循环参数：

注：为获得最佳效果，可根据需要调整退火温度。
通过在琼脂糖凝胶上加载3-5μl的PCR产物检查扩增是否成功。

的 D3。 DpnI消化模板

向扩增反应液中加入2μl所提供的限制性内切酶，并通过上下移液来混合溶液。
将混合物在37℃孵育1-2小时以消化未突变的甲基化模板DNA。

的 D4。转型

在冰上解冻提供的XL10-Gold超感受态细胞（或另一种感受态细胞株）的等分试样（45μl）。
将2-4μl的Dpn I处理的DNA转移到细胞中并轻轻旋转以混合组分。
在冰上培养转化反应30分钟
在42°C加热脉冲管30秒。
在冰上孵育2分钟。
将整个转化反应平铺在含有用于质粒载体的合适抗生素的琼脂平板上。
在37℃孵育琼脂平板> 16小时。

的 D5。挑选菌落，质粒分离，消化

从琼脂平板挑取24个很好分离的菌落并接种含有5ml LB培养基和适当浓度的抗生素的培养管。以250rpm和37℃摇动> 7小时。
根据制造商的说明书，使用碱裂解或质粒小量制备试剂盒分离质粒DNA。
用适当的限制性内切酶消化分离的DNA，以验证质粒中小基因的存在。
注：检查定点突变是否会产生新的或删除现有的限制性位点。如果是这种情况，用适当的限制酶直接消化可以确定QuikChange PCR的成功。
在使用前确认正确质粒的序列。

将小基因亚克隆到rAAV cis载体质粒中使用适当的限制性位点，使用标准克隆技术将您的突变小基因克隆到rAAV载体中。
注：在rAAV生产之前检查ITR完整性。 AAV ITR包含SmaI（或XmaI）位点，可用作ITR完整性的诊断。

笔记

不是所有的基因都适合用rAAV介导的基因表达进行体内剪接分析。如果含有启动子，小基因和poly-A信号的表达盒的大小超过4.7kb，则可以使用慢病毒来源的载体系统。
代替基于PCR的克隆，小基因也可以通过基因合成从商业供应商订购。
在仅使用小基因进行mRNA剪接的情况下，待分析的外显子应侧接至少两个额外的天然外显子，包括各自的全长或缩短的内含子序列。与中间外显子形成对比的是，其余两个外显子不一定需要两侧都有相应的内含子序列。
由于深部内含子区域也可能含有剪接调控元件，因此只有在必要时才能缩短天然内含子。
如果某些重叠PCR没有获得PCR产物，请考虑改变重叠区域的长度。或者，改变步骤C1.2中用于初始重叠PCR的模板PCR扩增子的熔解温度和/或顺序（参见图2）。

食谱

1x TBE缓冲液
LB培养基/ LB琼脂平板

混合所有试剂。如果制作琼脂平板，也可以在溶液中加入15克琼脂。将溶液在121℃高压灭菌10分钟。如果制作选择性培养基或琼脂平板，一旦培养基冷却至50°C后，加入适当浓度的所需抗生素。对于琼脂平板，将培养基倒入培养皿中

致谢

我们感谢Berit Noack宝贵的技术支持。这项工作由Deutsche Forschungsgemeinschaft资助，授权号为BE 4830 / 1-1。作者声明他们没有竞争利益。

参考

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