材料和试剂

2μl微量移液器
200μl微量移液器
1,000μl微量移液器
2,200和1,000微升微量移液器的技巧
用Sylgard（Dow Corning，Sylgard 184 Silicone Elastomer试剂盒）包被的培养皿，100×20mm
外科手术针（Rudolf，目录号：RU 5899-01）
棉线
所需基因型和年龄的小鼠
氯化氢（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：H1758）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
氯化镁，标准溶液1M（MgCl 2）（Honeywell International，Fluka，目录号：63020）
氯化钙二水合物（CaCl 2•2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C5080）
D - （+） - 葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7528）
林格的解决方案（见食谱）

设备

容量瓶
Clamp（Bulldog Clamp，Diethrich）（Rudolf，目录号：RU 3934-16;或类似）
2把剪刀（精密手术剪刀）（Rudolf，目录号：RU 1503-12）
2把镊子（微型珠宝镊子，弯曲）（Rudolf，目录号：RU 4240-07）
刺激器：6002刺激器（哈佛仪器，型号：6002基本刺激器）
2×显微操作器（三维粗手动操作器）（NARISHIGE，目录号：M-152）
2 x张力传感器：等轴传感器（Harvard Apparatus，目录号：72-4494）
2 x前置螺丝定位器（Harvard Apparatus，目录号：53-2082W）
2个支持系统（用于容纳刺激室和换能器传感器）
2×静电刺激室（夹套，总内容积5毫升）
恒温浴（Isco，目录号：GTR190）
录音单元：i-WORX 118系统（iWORX，型号：iWORX 118）
计算机与软件兼容
装有压力控制器的空气罐（95％O 2，5％CO 2）（液化空气，型号：HBS 240-1-2）

软件

记录和分析：i-WORX 118系统（Dover，NH，USA）通过Labscribe软件（iWorx Systems Inc.，多佛尔，新罕布什尔州，美国）

程序

解决方案和设置准备
1. 准备林格溶液（配方1），并通过95％O 2，5％CO 2通气至少15分钟使其饱和，以将pH缓冲至7.4。通气过程中，加入1 mg / ml葡萄糖（完全林格溶液）。
  注意：一次标准实验需要约50 ml的溶液。
2. 打开设置的所有组件并运行Labscribe软件（参见图1）。
  
  图1.电生理设置组件。 A.设置概述。 1）肌肉室; 2）刺激器; 3）张力传感器; 4）数据采集系统; 5）带有Labscribe软件的计算机系统。 B.肌肉腔室细节。 6）支持系统; 7）静电刺激室; 8）用氧气插管肌肉支持; 9）微操纵器; 10）铂电极; 11）螺丝定位器; 12）传感器传感器。
解剖
1. 安乐死小鼠，最好是颈椎脱臼。
  备注：
  1. 所有程序均按照意大利法律和政策（2014年3月14日第26号法令）执行，其中欧洲共同体委员会指令no 2010/63 / UE制定的指南以及帕多瓦（OPBA-Organismo Preposto al Benessere degli Animali）（议定书359/2015）。所有的程序应该根据进行实验的机构的道德标准来使用。
  2. 可以进行断头放血，以避免肋骨内出血和凝块形成。
2. 将鼠标以仰卧位固定在支架上，取出胸部和腹部的皮肤，打开肋骨下的腹膜。
3. 删除胸肌以暴露肋骨。
4. 用夹子牢牢固定胸骨的下肢，并在其上做一个中心切口，大约在第二根肋骨的水平面上;继续切割胸廓的右侧和左侧，使隔膜暴露（见图2A）。
  注意：在切割时，不要按照肋骨的走向，而要切碎它们。
5. 完全移除肋骨的上部（见图2B）。
  
  图2.用于隔膜移植的肋骨开口
6. 轻轻地移开心脏和肺叶以发现左侧膈神经（它形成白色的弓，见图3A）。使用镊子，将棉线插入神经下方，上部并做两个结。小心地切开结的背后的神经;抓住线（避免可能导致神经损伤的过度拉伸），尽可能隔离除去附着组织的神经;建议从结节开始，轻轻向膈肌进行。已清除的神经更容易安装和刺激，但这需要谨慎处理以避免神经伸展或损伤，特别是靠近神经插入点进入肌肉。轻轻地将孤立的神经放在肌肉上（见图3B和3C）。对右侧膈神经重复这些操作。注意：右侧神经与血管非常接近，血管的损伤可能导致恼人的出血（见图3D和3E）。这些步骤的结果如图3F所示。
  
  图3.两个膈神经的分离和结扎程序。 D：隔膜; P：膈神经。白色箭头：结位置。白色虚线：膈神经的位置。红色虚线：沿右侧膈神经的血管。 A中的黄色虚线：整个膈肌区域。
7. 使用胸骨下部保持膈肌，以避免损伤肌肉纤维;去除粘附在隔膜腹侧的结缔组织（图4A中的箭头）。通过切割肌肉的背部部分（图4B中的箭头）来移除隔膜。
  注意：密切注意斑点神经插入点并避免它们分裂。
  
  图4.膈肌移植
8. 将制剂转移到培养皿（直径10厘米）中，用sylgard制成底部并装满5-10ml完全林格溶液;钉住肌肉，如图5A所示。
9. 通过沿着图5A中所示的虚线切割并且用胸骨附件丢弃中心楔，将整个肌肉分成两个半膈，每个半膈都由其自己的膈神经支配。这个处理的结果是两个三角形，其中之一显示在图5B中。
  注：通过目前的解剖程序，获得两个半中膜，允许两个平行但独立的分析，这是一个显着的优势。
10. 在三角形的顶端系上一根棉线，将制剂连接到换能器上，在不钻组织的情况下制作双结。使用三角形底部的肋骨将准备工作固定到支撑上：在肋骨之间钻取组织，穿过棉线并在下肋条周围形成双结（图5B）。
  定位支架并通过支架上的双结系住三角形的底部（图5C）。
  
  图5.半隔膜分离和安装在纸巾架上
神经刺激和采集
1. 非常小心地将制剂转移到刺激室中（在37℃下用4ml完全林格溶液填充）。设置O 2 压力使气体连续但温和地起泡。用三角结把三角形顶端的线固定到传感器传感器上（图6A）。
  注意：
  1. 对于完整的力传导，肌肉必须垂直于传感器传感器的轴线（尽可能多的垂直线）;螺纹与设置的其他部分接触可能会改变测量结果并且必须避免（图6B）。肌肉抽动由等距传感器记录，该传感器将电信号中的机械力转换成由Labscribe软件显示的数字信号。
  2. 通过向换能器施加已知值的权重并记录相应的伏特值，可以建立校准曲线;这个程序允许表示牛顿肌肉收缩力（或克）。当结果作为标准值提供时，测量单位无关紧要（见下文）。
2. 使用丝杠定位器（图6A）拉伸肌肉，直到其张力达到约0.2 V（静止张力）。
3. 将连接到膈神经的棉线穿过刺激电极的两个铂环（图6C中的箭头）。使用显微操作器，小心地移动刺激室内的电极。拉动棉线，直到膈神经与环接触（图6C）。
  注意：神经必须完全浸入溶液中，理想的是垂直于肌肉，避免过度紧张。电极不能与肌肉接触，以防止直接刺激肌肉 s。
  
  图6.实验装置的细节 A.打结棉线的传感器传感器。星号表示螺丝定位器。 B.棉线（平行于白色虚线）和半隔膜之间的连接。 C.室内膈神经的最终定位。黑色箭头：电极环神经通过并接触它。
4. 设置膈神经刺激的标准参数。幅度：5 V（超最大刺激）;脉冲宽度：0.1毫秒;频率：0.1Hz。开始肌肉抽搐的刺激和测试。
  注意：在这些情况下，膈肌肌肉准备可以抽搐至少4小时。
5. 如果肌肉正常收缩，请使用螺丝定位器调整最适合抽搐反应的张力。缓慢增加肌肉张力反复次数，交替10-15分钟的肌肉稳定期，直到增加静息张力，抽搐幅度不再增加。
  最佳静息张力约为0.3 V.
6. 让肌肉抽搐在开始实验之前或在加入治疗前在37°C稳定20分钟。
  注意：在这段时间结束时测量的平均抽搐幅度用于标准化治疗后的抽搐值。
7. 将治疗直接加入刺激室。
8. 使用带有Labscribe软件的i-WORX 118系统，记录所需时间的肌肉抽搐，或者直到肌肉力量完全消失。

数据分析

抽搐幅度计算为刺激后的张力峰值（图7中的αn）与刺激前的平均基础张力（时间间隔bn中的静息张力的平均值图7中的）。在标准条件下，该值至少保持4小时。

图7. Labscribe软件在数据记录过程中显示的典型痕迹
通过添加冲击神经肌肉传输（突触前或突触后间隔）的治疗，颤搐振幅随时间下降（图8A）。在完全瘫痪的情况下，麻痹半时间（T 50％）被定义为将颤搐幅度减小到初始值的50％所需的时间（图8B），通常用于评估治疗的效力。

图8.使用MPN与肉毒杆菌神经毒素血清型A进行的典型实验。红色箭头：加入毒素（200pM），假定时间= 0. A.用Labscribe软件记录的原始数据;在如图7中计算的从-10到0'的时间间隔（T min）中颤搐幅度的平均值被用于归一化随后的幅度值。 B.相对于时间函数的标准化颤搐幅度图和麻痹性半衰期（T 50％，黑色箭头）的计算。
对于比较研究（例如突变体毒素与野生型毒素），建议使用从同一动物收获的两个半膈进行平行实验以减少变异性，并将数据报告为配对观察值。或者，可以将毒素作为参照进行效价校准曲线，然后用于推断其他毒素批次或变体的相对效力（Bigalke and Rummel，2015）
不同的毒素（或其他物质）可能需要各种实验条件（Caccin等人，2006年）。
注：使用附加电极（未显示）可以检测肌肉纤维功能，以直接刺激肌肉。

食谱

林格的解决方案

备注：
1. 使用ddH 2 O。玻璃器皿必须用0.1N氯化氢洗涤以除去任何痕量碳酸盐，并用ddH 2 O em冲洗。存在任何沉积物或乳光时，请勿使用溶液。
2. 所使用的缓冲区是一种定制的林格解决方案;在整个协议中，为简单起见，它被表示为“Ringer's”。
3. 在分析之前，林格氏溶液被95％O饱和，5％CO 2 通过通气至少15分钟以获得7.4的pH并补充有葡萄糖（终浓度1mg / ml，11mM）（氧饱和度和葡萄糖补充后的缓冲液在这个协议中被表示为'完整的林格溶液'）。葡萄糖对于记录时间超过1小时是必需的。

致谢

这项工作得到了帕多瓦大学的支持，其中'帕多瓦大学未就业青年高级研究资助'授予M. Pirazzini，并与S. Negro授予“初级研究员”，Fondazione Caritro授予'Bando 2017每Giovani ricercatori coinvolti in progetti di eccellenza'授予G. Zanetti。所有程序均在由生物医学科学系（帕多瓦大学）Cesare Montecucco教授领导的'神经毒素，神经麻痹和再生'实验室中进行。作者声明没有竞争利益。 PC进行半膈肌制备的程序。 SN和GZ拍照描述所有的程序并准备好数字。 GZ和PC在SN和MP的帮助下写了这篇文章。所有作者都回顾了手稿并批准了最终版本。

参考

Azarnia德黑兰，D.，Zanetti，G.，Leka，O.，Lista，F.，Fillo，S.，Binz，T.，Shone，CC，Rossetto，O.，Montecucco，C.，Paradisi，C.， Mattarei，A.和Pirazzini，M.（2015）。一种新型抑制剂可预防肉毒杆菌神经毒素的外周神经麻痹。 5：17513.
Bercsenyi，K.，Schmieg，N.，Bryson，JB，Wallace，M.，Caccin，P.，Golding，M.，Zanotti，G.，Greensmith，L.，Nischt，R.和Schiavo，G。（2014年）。 Nidogens是预防破伤风的治疗目标。科学 > 346（6213）：1118-1123。
Beske，P.H.，Bradford，A.B.，Hoffman，K.M.，Mason，S.J。和McNutt，P.M。（2017）。体外和 ex vivo 筛选候选治疗剂可恢复由肉毒杆菌神经毒素血清型A1导致的神经末梢神经传递。 Toxicon 。 doi：10.1016 / j.toxicon.2017.10.017。
Bigalke，H.和Rummel，A。（2015）。肉毒神经毒素：使用鼠标膈神经偏侧膈测定（MPN）毒素（巴塞尔） 7（12）：4895-4905。
Caccin，P.，Rigoni，M.，Bisceglie，A.，Rossetto，O。和Montecucco，C。（2006）。不同溶血磷脂诱导的可逆性骨骼肌肉麻痹 FEBS Lett 580（27）：6317-6321。
Caccin，P.，Scorzeto，M.，Damiano，N.，Marin，O.，Megighian，A.和Montecucco，C.（2015年）。突触前膜近膜区涉及神经细胞增生 FEBS Open Bio 5：388-396。
Klooster，R.，Plomp，JJ，Huijbers，MG，Niks，EH，Straasheijm，KR，Detmers，FJ，Hermans，PW，Sleijpen，K.，Verrips，A.，Losen，M.，Martinez-Martinez，P. ，De Baets，MH，van der Maarel，SM和Verschuuren，JJ（2012）。肌肉特异性激酶重症肌无力IgG4自身抗体在小鼠中引起严重的神经肌肉接头功能障碍 Brain 135（Pt 4）：1081-1101。
Li，L.，Xiong，W.C.和Mei，L。（2017）。神经肌肉接头的形成，衰老和障碍 Annu Rev Physiol 。
Nascimento，F.，Pousinha，P. A.，Correia，A. M.，Gomes，R.，Sebastiao，A. M.和Ribeiro，J. A.（2014）。腺苷A2A受体激活促进SOD1（G93A）ALS小鼠的症状前阶段的神经肌肉传递，但不是在症状阶段。 PLoS One 9（8）：e104081。
Rasetti-Escargueil，C.，Liu，Y.，Rigsby，P.，Jones，R.G和Sesardic，D。（2011）。膈神经 - 膈肌作为测定功能性肉毒杆菌毒素抗体的高度敏感的替代测定。 Toxicon 57（7-8）：1008-1016。
Rigoni，M.，Caccin，P.，Gschmeissner，S.，Koster，G.，Postle，A. D.，Rossetto，O.，Schiavo，G。和Montecucco，C。（2005）。蛇PLA2神经毒素和溶血磷脂脂肪酸混合物的等效效应科学 310（5754）：1678-1680。
Yan，Y.，Li，J.，Zhang，Y.，Peng，X.，Guo，T.，Wang，J.，Hu，W.，Duan，Z. and Wang，X.（2014）。黑寡妇蜘蛛卵提取物的生理生化特征揭示卵毒性的分子基础。 a> Biol Res 47：17.
Zanetti，G.，Sikorra，S.，Rummel，A.，Krez，N.，Duregotti，E.，Negro，S.，Henke，T.，Rossetto，O.，Binz，T。和Pirazzini，M.（ 2017年）。肉毒杆菌神经毒素C突变体揭示了syntaxin或SNAP-25蛋白水解对神经肌肉传递的不同作用。 PLoS Pathog 13（8）：e1006567。