材料和试剂

显微镜幻灯片（，例如，Carl Roth，目录号：H868.1）
封页（例如，Carl Roth，产品目录号：H873.2）
2毫升反应管（例如，，SARSTEDT，目录号：72.695.500）
50毫升猎鹰管（，例如，SARSTEDT，目录号：62.559.001）
6毫升带螺纹盖的培养管，带耐氯仿的聚四氟乙烯密封（例如，DWK生命科学公司，DURAN，目录号：26135115）
GC玻璃小瓶（如，Brown，目录号：155710）
50毫升Omnifix注射器（例如，B.Braun Medical，目录号：4591281）
无菌过滤器Filtropur S 0.2（例如，SARSTEDT，目录号：83.1826.001）
手术刀刀片（，GebrüderMartin，KLS Martin，目录号：10-155-24-04）
移液器吸头1,000μl（，例如，SARSTEDT，目录号：70.762.010）
移液器吸头200μl（，例如，SARSTEDT，目录号：70.760.002）
移液器吸头10μl（，例如，VWR，目录号：53509-070）
1.5毫升试管（，例如，SARSTEDT，目录号：72.690.001）
0.3毫升有限容积的插入物（，例如，布朗，目录号：155650）
（如，Brown，产品目录号：155615）
生物
1. 富养罗尔斯通氏菌H16（替代品系命名：富养氢氧化氢真菌H16，真养产碱杆菌H16，Wautersia eutropha H16， > Cupriavidus necator H16）。 DSM 428（Deutsche SammlungfürMikroorganismen和Zellkulturen GmbH， https://www.dsmz.de/ ）。野生型菌株产生PHB和相关的短链PHA
2. 由于PHB合酶（phaC ）基因中的突变G320A（Raberg等人，H16-PHB-4（DSM 541），菌株H16的PHB阴性突变体，2014）
PHB（例如，Sigma-Aldrich，目录号：363502）
琼脂糖标准品（如，Carl Roth，目录号：3810.4）
氮气（例如，液化空气，ALPHAGAZ TM 1 Stickstoff，目录号：P0271L50R2A001）
氦气（例如，液化空气，ALPHAGAZ TM 1 Helium，AIR LIQUIDE Deutschland，目录号：P0251L50R2A001）
合成空气（例如，液化空气，ALPHAGAZ TM 1 Luft，AIR LIQUIDE Deutschland，目录号：P0291L50R2A001）
辛烷（例如，Sigma-Aldrich，目录号：74821）
尼罗红（例如，Sigma-Aldrich，目录号：N3013）
DMSO（例如，Carl-Roth，目录号：7029.2）
三氯甲烷/氯仿（如，Carl Roth，目录号：6340.2）
用于GC的甲醇（如，VWR，目录号：20864.320）
苯甲酸甲酯（例如，Sigma-Aldrich，目录号：M29908）
硫酸96％（例如，Carl Roth，目录号：4623.1）
果糖
营养肉汤（例如，BD，Difco TM，产品目录号：231000）
Na 2 HPO 4•12H 2 O
KH <2> PO <4>
NH 4 Cl
MgSO 4•7H 2 O。
CaCl 2•7H 2 O O 0
柠檬酸铁铵
ZnSO 4
MnCl 2•4H 2 O•O
H 3 BO 3
CoCl 2•6H 2 O•O 0
CuCl 2 2•2H 2 O
NiCl 2•6H 2 O•O
NaMoO•4•2H 2 O•O
D-葡糖酸钠盐（例如，Sigma-Aldrich，目录号：G9005）
NB媒介（见食谱）
无机盐培养基（见食谱）
D-葡糖酸钠盐溶液（20％原液）（见食谱）
尼罗红溶液（见食谱）

设备

100ml锥形瓶（例如，DWK Life Sciences，DURAN，目录号：21 216 24）
500毫升锥形瓶（例如，DWK生命科学公司，DURAN，目录号：21 216 44）
3升锥形烧瓶（如，DWK Life Sciences，DURAN，目录号：21 216 68）
孵化振动筛（，例如，INFORS HT）
移液器（如，Thermo Scientific）
刮刀
离心机（例如，Eppendorf，型号：5417C）
冷冻干燥机（，例如，Christ，型号：Alpha 1-2 LDplus）
旋转叶片泵（例如，Pfeiffer Vacuum，型号：DUO 5 M）
分析天平（例如，，Sartorius，型号：A 200 S）
通风橱
油浴（如，Memmert）
气相色谱仪（例如，Agilent Technologies，型号：Agilent 7890A;火焰离子化检测器（FID））
用于GC的气密注射器（如，VWR，目录号：5490572）
制造商：Hamilton，型号：1701 SN CTC。
CTC自动进样器（例如，安捷伦科技，产品目录号：G6501-CTC）
GC色谱柱DB-WAX（，Agilent Technologies，产品目录号：122-7032）
具有Plan Apo物镜（100x / 1.4油）的荧光显微镜（例如，Nikon Instruments，型号：Eclipse Ti-E）
尼罗红滤色片（激发：562/40纳米/发射：594（长传）， eg ，AHF Analysentechnik AG，德国图宾根， www.ahf.de/ ）
内衬4mm ID LPD（例如，，Agilent Technologies，目录号：5183-4647）
冷冻机
无菌工作台（，例如，HERA安全）
冷藏猎鹰离心机（例如，，Sigma Zentrifugen，型号：4K15）
涡流
实验室玻璃瓶（例如，DWK Life Sciences，DURAN，目录号：21 801 54 5）
高压灭菌器

软件

GC化学工作站B.04.01版SP1，安捷伦
Excel，Microsoft，Redmont，美国
尼康成像软件
ImageJ Fiji vl.50c

程序

注意：确保妥善考虑处理危险化合物和废物管理的所有安全说明;因为这些可能在不同的国家有所不同，下面的协议不提供任何有关这些问题的指导。

尼罗红染色

见尼罗红染色程序概述图3

图3.尼罗河红染色流程图

注意：尼罗红染色可以使用培养的细胞进行气相色谱分析，也可以从为显微镜实验准备的独立培养物中进行细胞染色。

细胞的制备
1. 在100ml烧瓶中接种10ml NB培养基（或允许物种良好生长以进行研究的培养基）的第一次种子培养物与单一菌落的富养罗尔斯通氏菌H16细胞并孵育在150rpm和30℃的摇床上振荡24小时。
2. 用1ml第一次种子培养物（1:10稀释）在100ml烧瓶中接种9ml NB培养基的第二次种子培养物。在150rpm和30℃的摇床上孵育细胞24-30小时。在NB培养基上的两个随后的种子培养的过程提供了R。由于存在主要为短杆状或几乎球状的细胞，所以处于静止生长期的富营养细胞。大部分细胞（> 95％）已经动员了任何先前积聚的PHB，并且细胞在尼罗红染色后看起来是“空的”。
3. 通过将1ml第二预培养物转移到补充有0.2％D-葡萄糖酸钠盐（100μl20％储备溶液）的9ml新鲜NB培养基（在100ml烧瓶中）接种主培养物并孵育细胞在150rpm和30℃的摇床上培养。葡萄糖酸盐增加培养基的C与N比并促进PHB的积累。如果研究不同的物种，可以加入其他通过乙酰辅酶A（PHB前体）代谢的C源以促进PHB，例如乙酸或葡萄糖的形成。
显微镜载玻片的制备
1. 标签显微镜幻灯片。
2. 在载玻片上吸取100μl热（〜60℃）琼脂糖溶液（H 2 O中1％[w / v]），准备琼脂糖垫，并立即将盖玻片置于琼脂糖上图4）。
  
  图4.用于显微镜的琼脂糖垫的制备
3. 让它凝固（≥2分钟），并用刀片小心地取下盖玻片。取下盖玻片后，应在接下来的两分钟内使用样品。否则，琼脂表面会变干。
尼罗红染色的细胞
1. 在PHB的积累和动员阶段期间，在主培养物接种后每2小时采样一次。第二次预培养的剩余细胞可以用作阴性对照，并表示时间点'0'（T0）。这些细胞（> 95％）应该没有累积的PHB。或者， R的单元格。富养菌体PHB-4可用作PHB颗粒积累的阴性对照。由于在R的PHB合酶基因细胞中发生突变，富营养化石PHB-4无法合成储存PHB（Raberg等人，2014年）。
2. 通过离心（60秒，13,000×gg）收获1ml培养物，丢弃上清液，并将沉淀重悬于剩余的约30-50μl培养基中，该培养基从底部的管壁聚集在〜1分钟。
3. 在反应管中加入4μl细胞到1μl尼罗红（工作溶液：DMSO中10μg/ ml，光敏，在4℃下稳定几个月）。
4. 将1μl或2μl染色的细胞悬液放在琼脂糖垫上，让其干燥几秒钟，小心地将盖玻片放在琼脂糖上。
显微镜分析
1. 使用合适的荧光过滤器对尼罗红（激发：562 / 40nm，发射594（长通道），AHF Analysentechnik AG，Tübingen，Germany， www.ahf.de ）。
  在明亮的场地下显示细胞。
2. 使用尼康成像软件或ImageJ Fiji v1.50c分析照片。

第二部分。使用气相色谱法测定PHB含量

请参见图5以了解使用气相色谱法确定PHB含量的程序大纲

图5.使用气相色谱法测定PHB含量的流程图

培养和收获细胞
1. 三个独立的殖民地和文化应该用于生物三重复
2. 根据将采取多少个样品（数据点）计算适当的培养体积量。当培养物的OD 600≤0.6时，对于数据点需要100ml的培养物。当培养物的OD600≥0.6时，对于数据点需要50ml的培养物。我们通常在48小时内每4小时采样一次。
3. 用10ml NB培养基接种第一次种子培养物，必要时使用适当的抗生素和em菌落。 eutropha H16细胞，并在30°C摇床中培养过夜至24小时。
4. 在NB培养基中稀释1:10接种第二次种子培养物，必要时接受适当的抗生素。在30°C摇床中孵育至少24-30小时，以除去所有先前积聚的PHB。培养物的体积应至少为50毫升，以便有足够的细胞从种子培养物中收获T0时间点并接种主要培养物。
5. 用NB培养基，0.2％葡萄糖酸钠和适当的抗生素按1:20的稀释度接种主要培养物，必要时将其在30℃的摇床中培养。
6. 在PHB的积聚和动员阶段期间，每4小时取50-100毫升样品。 T0代表第二次预培养。主要培养物的体积应比所有数据点收获的总量高50毫升。
7. 通过在5,000×g和4℃下离心20分钟，在50ml Falcon管中收获50-100ml培养物。
8. 弃去上清液并在-20°C冻结沉淀至少2小时。
冻干和称量样品
1. 为了冻干细胞颗粒，稍微打开Falcon管的盖子或使用带有预留孔的盖子。
2. 将Falcon管置于冷冻干燥器中，通过打开（旋转）真空泵启动干燥过程。将样品冷冻干燥至少24小时。当细胞团块干燥时，冻干样品完成。没有任何残留水分/湿气是重要的。
3. 使用刮刀将所有细胞团粒破碎成小团块。
4. 在分析天平上称取约10mg冷冻干燥的细胞团块放入带耐氯仿PTFE密封的带螺旋盖的培养管中。如果颗粒大小有限，可以使用更少量的冻干细胞，但（质量）重量应始终在5-10毫克之间。
  注意：确定准确的细胞质量（重量）用于以后的计算很重要。
5. 为了生成PHB校准曲线图，分别将2 mg，4 mg，6 mg和8 mg纯PHB分别称重到带有螺帽的培养管中。
酸性甲醇分解和GC样品制备（图6）
注意：所有步骤应在通风橱中进行。
1. 加入1毫升氯仿到培养管中
2. 加入1ml补充有15％（v / v）H 2 SO 4（150μlH 2 SO 4） /每个样品+850μl甲醇）到含有加权干细胞的特殊培养管中。紧紧闭合管并涡旋三秒钟。
  所有颗粒团应该在溶剂混合物中。
3. 在配有恒温器的油浴中，在100°C孵育管2小时30分钟。应用温度高于甲醇和氯仿的沸点时，请按照当地安全说明进行操作。
  完整的密封和玻璃管中没有任何裂缝是必不可少的。
4. 在冰上冷却样品5分钟。
5. 加入1ml去离子水和1ml含0.2％（v / v）苯甲酸甲酯（2μl苯甲酸甲酯+每份样品998μl氯仿）的氯仿作为内标。
  注意：所有样品都使用相同的氯仿 - 甲基苯甲酸酯混合物，以避免稀释错误。
6. 紧紧闭合管并剧烈漩涡30秒。
7. 让管子静置一分钟以使相分离。
8. 移取150微升有机（底部）相到0.3毫升有限容量的GC玻璃小瓶中。
9. 关闭GC瓶的螺帽。
10. 用150μl纯氯仿作为色谱柱的平衡溶剂准备一个GC小瓶。
11. 将1ml纯氯仿和1ml氯仿甲苯甲酸酯混合物移入培养管中以制备外标。将150μl混合物转移到GC小瓶中。
  
  图6. PHB酸性甲醇分解步骤的图像。（A），油浴（B）之前的完全甲醇分解样品，油浴（C）之后的样品和具有底部有机相的相分离样品（白色箭头D）。
GC测量
1. 将所有GC样品瓶放入GC托盘。
2. 用不同的样品用辛烷重新装满用于冲洗注射器三次的所有玻璃瓶。
3. 清空所有废液瓶。
4. 根据制造商提供的说明安装气相色谱仪和CTC自动进样器，并安装气密注射器和适当的衬管。
5. 使用DB-WAX柱作为固定相，惰性气体氦气作为流动相分离甲酯。
6. 编程1μl的注射体积，分流比为1：8，注射温度为250℃的分流模式。
7. 编程流量为0.7毫升/分钟。
8. 为以下温度梯度编程分离甲酯：
9. 使用火焰离子化检测器（FID）在275°C进行检测

数据分析

第一部分尼罗红染色 - 图像分析

使用Nikon成像软件或ImageJ Fiji v1.5分析拍摄的照片，如图7所示。

图7.具有和不具有PHB的细胞的荧光显微照片。从左到右：明亮的场地，尼罗河红色，明亮的场地和尼罗河红色的合并渠道。上图：具有PHB颗粒的细胞，下图：没有PHB颗粒的细胞。
注意：细胞可能含有“黑色”内含物（例如，下图中的大多数上层细胞），不会被尼罗红染色。这些内含物可能代表其他包涵体/结构（如聚磷酸盐颗粒）。

第二部分。用气相色谱法测定PHB含量

双击感兴趣的样品名称打开色谱图。
3-羟基丁酰甲基酯（3HBME）应在7.0-7.1分钟洗脱。内标（苯甲酸甲酯）应在8.7-8.8分钟洗脱。确切的保留时间是设备和条件特定的，可能会有所不同。如果细胞累积3HB和3-羟基戊酸（3HV）的共聚物，3HV甲酯（3HVME）的保留时间约为7.9-8.0分钟。同样的方案也可以应用于中链长度PHA的分析和检测。具有6,8,10和12个C原子的3-羟基链烷酸的甲酯在约9.0分钟（C6），约11.4分钟（C8），约13.5分钟（C10）和约15.5分钟（C12）洗脱，（未显示）。
点击集成按钮（图8中的红色方块）。
如果峰值太小而无法自动集成，可以通过按下手动集成按钮（图8中的绿色框）并使用鼠标光标在峰值下绘制粉红线来手动集成它。
曲线下面积的值将列在色谱图下方的表格中（图8中的橙色框）。

图8. 3HVME和3HBME的色谱图和结果表（A）和代表性色谱图的截图（B）
将PHB标准曲线的所有样品和待分析的所有样品的3-羟基丁酰甲基酯（3-HBME）峰和苯甲酸甲酯峰下的面积值复制到excel表中。
使用公式计算3-HBME峰的归一化面积：
通过绘制PHB标准样品的标准化区域来创建标准曲线在y轴上对抗x轴上PHB的加权量（图9），并确定函数的方程（y = a * x + b）。

图9.测定PHB重量的标准曲线。一条线连接数据点，第二条线是用于生成线的方程的趋势线。
使用公式计算样本中PHB的重量：
使用公式计算PHB每细胞干重的百分比：
用您选择的程序表示图表中的PHB内容（图10）。

图10. R的增长（A）和PHB生产（B）的例子。在富含0.2％葡糖酸钠（复合培养基）的NB培养基上或富含2％果糖的矿物盐培养基上的富营养化石H16

食谱

NB媒介
1. 称取8克NB粉末，装入1000毫升玻璃瓶中，加入1000毫升去离子水。将其混合并在121°C高压灭菌20分钟
2. 在室温下储存NB培养基
矿物盐介质
可以使用适合感兴趣菌株生长的任何无机盐培养基。对于Ralstonia eutropha H16，我们使用以下培养基。为了制备1,000ml培养基：
1. 将9克Na 2 HPO 4•12H 2 O，1.5克KH 2 PO 4，使用磁力搅拌器在≈950ml去离子水中的1g NH 4 Cl和1g NH 4 Cl。
2. 添加1毫升以下的1,000x储备溶液镁溶液（200g / L MgSO 4•7H 2 O）
  Ca溶液（20g / L CaCl 2•7H 2 O）
  铁溶液（1.2克/升柠檬酸铁铵）
  注意：在加入Mg，Ca和Fe溶液过程中，磁力搅拌器的运行非常重要。否则可能会形成白色沉淀。
3. 最后，加入100μl微量元素溶液
  每升微量元素原液的数值：1g ZnSO 4，0.3g MnCl 2•4H 2 O，3g H 3 BO 3，2克CoCl 2•6H 2 O，0.1克CuCl 2•2H 2 O 2,0.2g NiCl 2•6H 2 O，0.3g NaMoO 4•2H 2 O用去离子水补足1000毫升的最终体积
4. 矿物盐介质的pH值应为pH 7.0±0.1。
5. 将培养基在121°C灭菌20分钟
备注：
1. 一旦灭菌就会形成少量的沉淀，在冷却和搅拌时会部分再溶解。剩余的少量沉淀物是可以容忍的。
2. 在感兴趣的菌株接种之前，添加所需量的碳源（例如，在高PHB应该积累的情况下，葡萄糖酸钠储备液高达2％）。
3. 可选地，氮源（NH 4 Cl：em）的量可以减少到0.5g / L。这将导致更高的碳氮比，并导致细胞生物量产量的降低，但会使每克细胞干重的PHB积累百分比增加到80％。
D-葡糖酸钠盐溶液（20％原液）
1. 通过将20g葡萄糖酸钠溶解在100ml去离子水中制备20％wt / vol的D-葡萄糖酸钠盐储备液
2. 通过无菌过滤器（0.2μm）过滤或加热灭菌（20分钟121°C）消毒溶液。
3. 储备溶液在室温下稳定
尼罗河红色解决方案
1. 准备1毫克/毫升的尼罗红储备溶液并将其溶解在DMSO中。
2. 用DMSO稀释原液，得到10μg/ ml的工作溶液
3. 尼罗河红色溶液可以在4°C下储存几个月
4. 保护光线下的解决方案

致谢

我们感谢Deutsche Forschungsgemeinschaft（DFG Je152 / 17-1）的资助。作者声明不存在利益冲突。

参考

Anderson，A.J。和Dawes，E.A。（1990）。细菌聚羟基链烷酸酯的发生，代谢，代谢作用和工业用途。 Microbiol Rev 54（4）：450-472。
Brandl，H.，Gross，R.A。和Lenz，R.W。（1988）。假单胞菌 oleovorans，作为聚（β-羟基链烷酸酯）的来源潜在的应用。 Appl Env Microbiol 54：1977-1982。
Bresan，S.，Sznajder，A.，Hauf，W.，Forchhammer，K.，Pfeiffer，D.和Jendrossek，D。（2016）。聚羟基链烷酸酯（PHA）颗粒不含磷脂。 Sci Rep 6：26612.
Chen，G.Q.（2009）。基于微生物聚羟基链烷酸酯（PHA）的生物和材料工业。 Chem Soc Rev 38：2434-2446。
Giretova，M.，Medvecky，L.，Stulajterova，R.，Sopcak，T.，Briancin，J。和Tatarkova，M.（2016）。聚羟基丁酸酯/壳聚糖/磷酸钙复合物中壳聚糖的酶促降解对体外成骨细胞反应。 J Mater Mater Mater Med 27：181。
Jendrossek，D。和Pfeiffer，D。（2014）。聚羟基链烷酸酯颗粒（碳纳米颗粒）形成的新见解和聚（3-羟基丁酸酯）。
Pacheco，D. P.，Amaral，M. H.，Reis，R. L.，Marques，A. P.和Correlo，V. M.（2015）。开发用于再生医学的可注射PHBV微粒-GG水凝胶杂交系统 Int J Pharm 478：398-408。
Raberg，M.，Voigt，B.，Hecker，M.和Steinbüchel，A。（2014）。详细了解真养罗尔斯通氏菌的聚羟基丁酸酯（PHB-）阴性表型， PHB-4。 PLoS One 9：e95907。
Riedel，S.L，Jahns，S.，Koenig，S.，Bock，M.C.E.，Brigham，C.J。，Bader，J。和Stahl，U。（2015）。采用低质量废弃动物脂肪制备富含Ralstonia eutropha的聚羟基脂肪酸酯。 a> J Biotechnol 214：119-127。
Spiekermann，P.，Rehm，B.H.，Kalscheuer，R.，Baumeister，D。和Steinbüchel，A。（1999）。使用尼罗红对敏感的活菌落染色方法进行直接筛选积累聚羟基链烷酸的细菌和其他脂质储存化合物。 Arch Microbiol 171：73-80。
Wu，Q.，Wang，Y.和Chen，G.Q.（2009）。微生物生物聚酯聚羟基链烷酸酯的医学应用 Artif Cells血液替代品Immobil Biotechnol 37：1-12。
Zonari，A.，Martins，T. M. M.，Paula，A. C. C.，Boeloni，J. N.，Novikoff，S.，Marques，A. P.，Correlo，V. M.，Reis，R. L.和Goes，A. M.（2015年）。装载有脂肪干细胞的聚羟基丁酸酯 - 共 - 羟基戊酸酯结构促进皮肤愈合并减少疤痕。 Acta Biomater 17：170-181。