材料和试剂

50毫升和15毫升螺旋盖管（SARSTEDT，产品目录号：62.547.254和62.554.002）
2毫升和1.5毫升微管（SARSTEDT，目录号：72.695.500和72.690.001）
5毫升注射器（BD plastipak，BD，目录号：302187）
剃须刀片（羽毛安全剃须刀，目录号：02.015.00.024）
培养皿，9.2厘米直径（SARSTEDT，目录号：82.1473.001）
CellTrics （孔径30μm）（Sysmex，目录号：04-0042-2316）
吸水纸（Kimberly-Clark，目录号：3020）
显微镜载玻片和盖玻片（VWR，目录号：631-1551和631-9430）
（4周龄，16小时光照，8小时黑暗，60％湿度下培养）的野生型植物（由Savenkov博士，乌普萨拉友好提供的种子）烟草本生烟草野生型植物成熟的叶子（平坦的表面和边缘）被使用
含有pUBC-UBP12-CFP质粒的根瘤土壤杆菌菌株GV3101（Derkacheva等人，2016）
含有pUBC-H3.3-CFP质粒的根癌土壤杆菌菌株GV3101（Derkacheva等人，2016）
含有病毒RNA沉默抑制子p19的根癌土壤杆菌菌株GV3101（由E.Savankov，Uppsala友情提供）
LB肉汤高盐（Duchefa Biochemie，目录号：L1704.2500）
甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：F8775）
抗体抗H2Aub（Cell Signaling Technology，目录号：8240）
抗体抗-H4（Merck，EMD Millipore，目录号：05-858）
抗体Alexa Fluor 555结合山羊抗兔试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A31629）
带有1μg/ ml DAPI（Vector Laboratories，产品目录号：H-1200）的VECTASHIELD®安装介质。
牛血清白蛋白（BSA）（Carl Roth，目录号：3737.2）
MES（Duchefa Biochemie，目录号：M1503）
氯化镁六水合物（MgCl 2•6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M9272）
乙酰丁香酮（Sigma-Aldrich，目录号：D134406）
Tris碱（VWR，目录号：28811.364）
EDTA二钠盐（Na 2 -EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：ED2SS）
氯化钠（NaCl）（Merck，目录号：567441）
37％HCl（Merck，目录号：1.00317.2500）
精胺（Sigma-Aldrich，目录号：85590）
氯化钾（KCl）（Merck，目录号：529552）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
磷酸二氢钠二水合物（NaH 2 PO 4•2H 2 O）（Merck，EMD Millipore，目录号：106342）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S3264）
渗透介质（见食谱）
Tris缓冲液（见食谱）
LB01裂解缓冲液（见食谱）
PBS缓冲液（见食谱）

设备

离心机（Eppendorf，型号：5804R和Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Heraeus TM Pico TM 17）
手术剪（DIMEDA Instrumente，目录号：08.340.11）
层流罩
移液器（Gilson，型号：PIPETMAN®Classic Classic，P2，P20，P200，P1000）
湿培养箱
共聚焦显微镜（ZEISS，型号：LSM 780）

程序

文化 A。分别在15ml螺旋盖管中的3ml液体LB中在28℃下将pUBC-UBP12-CFP，pUBC-H3.3-CFP（作为对照）或p19持续20小时， >
在室温下将培养物在2ml微管中离心5分钟5分钟，丢弃上清液，然后通过调节OD 将悬浮在渗透培养基中的根瘤农杆菌沉淀物> 600 至1.0。
将相同量（通常1ml）的pUBC-UBP12-CFP或pUBC-H3.3-CFP与（1ml）p19培养物在2ml微管中合并。
注意：p19构建体可以增加转染的本氏烟草细胞中转基因的表达。没有p19表达，转染的本氏烟草细胞经常沉默转基因，导致低表达和可变表达。 p19的存在部分阻断RNA沉默，从而建立更高和更均匀的转基因表达，使得所提供的测定更灵敏并且更可重复。
在室温下将微管水平放置2小时。
用针在3至4em的背面（下）侧打孔。使用5毫升注射器将本生叶培养物浸入土壤杆菌培养物中。
在渗透后48小时和72小时之间，使用剪刀将渗入的孔附近的烟草叶片的面积切成约1×1cm的片，并在10ml含有4％甲醛的Tris缓冲液中在50ml螺帽管中固定冰20分钟（在层流罩中操作以避免暴露于甲醛）。
倒出Tris缓冲液，用20ml冰冷的Tris缓冲液洗涤样品两次，每次10分钟。
在冰上的培养皿中用400μlLB01缓冲液将叶片用刀片切下，以释放核。
通过CellTrics ®将悬浮液过滤到新的1.5 ml微管中。
吸取5到10微升悬浮液到显微镜载玻片上并风干悬浮液（约5到10分钟）（注1）。
吸取100μl含有4％甲醛的PBS缓冲液至载玻片上以在室温下在核后30分钟（在层流罩中操作以避免暴露于甲醛），然后倾斜载玻片并用吸收纸吸收PBS缓冲液（注意2）。
吸取100μlPBS缓冲液到载玻片上以覆盖细胞核漂洗5分钟，然后倾斜载玻片并用吸水纸吸收PBS缓冲液，重复一次。
用100μl0.2％Triton X-100（在PBS缓冲液中稀释）使细胞透化5分钟，然后倾斜玻片并用吸水纸吸收PBS缓冲液。
吸取100μlPBS缓冲液到载玻片上冲洗样品，然后倾斜玻片并用吸水纸吸收PBS缓冲液，重复3-4次。
使用足够的体积（20-100μl）Image-iT TM TM FX信号增强剂覆盖原子核。在潮湿的培养箱中孵育30分钟（注3和4）。
吸取100μlPBS缓冲液到载玻片上，然后倾斜载玻片并用吸水纸吸收PBS缓冲液。
抗体检测：将1μl抗H2Aub或抗H4（作为阴性对照）与100μl1％BSA的PBS缓冲液混合，将溶液吸到载玻片上，并在37℃的潮湿培养箱中孵育2 h（注4）。
吸取100μlPBS缓冲液到载玻片上，在室温下冲洗细胞核三次，每次10分钟。倾斜玻片，每次吸水纸吸收PBS缓冲液。
将5μlAlexa Fluor 555结合的山羊抗兔抗体与1 ml 1％BSA的PBS缓冲液混合，将溶液吸到载玻片上并在37℃孵育30分钟。
在室温下将100μlPBS缓冲液移至载玻片上三次，每次10分钟。倾斜玻片，每次吸水纸吸收PBS缓冲液。
用含有1μg/ ml DAPI的VECTASHIELD®安装介质移液到显微镜载玻片上并盖上盖玻片。
使用适当的激发波长，在共焦显微镜如ZEISS LSM 780下观察细胞核（DAPI），CFP信号和抗体信号。 DAPI由405 nm激光线激发; 485nm激光线检测CFP，而555nm激光线激发抗体。 DAPI显示来自转染细胞的细胞核和CFP标记核的位置。检查几个领域（大约50个核），并比较渗透 benthamiana 叶与 A时的差异。携带pUBC-UBP12-CFP或pUBC-H3.3-CFP的根癌农杆菌。图1显示转染细胞核的显微镜检测和分析的组蛋白翻译后修饰（PTM;此处为H2Aub）的免疫细胞化学实例。我们发现与表达H3.3的对照细胞相比，在表达UBP12的细胞中H2Aub信号显着降低（图1A）。相反，当UBP12或H3.3在N中表达时，H4信号没有显着差异。本氏烟叶（图1B），暗示UBP12的去泛素化活性。

图1.测定结果实例 - UBP12具有去泛素化酶活性。：一种。 pUBC-UBP12-CFP而不是pUBC-H3.3-CFP的渗透降低了N中的H2A泛素化。本生烟叶叶。 B.pUBC-H3.3-CFP或pUBC-UBP12-CFP的渗入不影响本氏烟草叶中的H4信号。比例尺= 30微米。

数据分析

检查包含至少50个核的几个域以进行统计分析。选择具有相似背景信号的区域，因为载玻片上的某些区域可能因冲洗不足而产生高背景。图2显示了测定结果定量分析的策略。
通过DAPI信号寻找细胞核（图1A和1B，左图）并使用CFP信号来选择用pUBC-H3.3-CFP（对照构建体）或pUBC-UBP12-CFP（测试构建体）成功转染的细胞核（图1A和1B，中心图）。比较转染率（图2A）;理想情况下，对照和测试构建体的转染率应该相似。用H2Aub或H4的荧光信号计数核数（图1A和1B，右图）。免疫细胞化学的检测效率可以表示为H4阳性细胞核的数量作为所有转染细胞核的百分比（图2B）。类似的值表明对照和测试构建体的检测过程（固定，染色，洗涤等等）是可比较的。对照和测试构建体对靶PTM的作用可以在转染后PTM阳性细胞核百分比的比较中看到（图2C）。测试值小于对照构建体，表明测试构建体特异性地降低了目标PTM。另一种显示是比较PTM阳性细胞核的相对频率（图2D）。为此，用对照构建体转染后PTM阳性细胞核的频率设定为1，并且用测试构建体转染后PTM阳性细胞核的频率相对于其表达。运作良好的测试构建体应该影响目标PTM，并因此显示PTM-阳性核的相对频率1.此显示直接显示转染或检测率不同时推荐的转染测试构建体的效应大小，结果应该在多个实验中进行比较，或者包含多个测试结构。

图2.组蛋白翻译后修饰（PTM;此处为H2Aub）测定结果的定量分析策略。对照和测试构建体（这里：pUBC-H3.3-CFP和pUBC-UBP12-CFP）分别由浅灰色和深灰色条表示。 A.转染率，即，CFP阳性核的数量占所有检测到的核的百分比。类似的杆高表明对照和测试构建体的转染率相似。 B.免疫细胞化学检测效率，即，H4阳性细胞核的数量占所有转染细胞核的百分比。类似的杆高表明对照和测试构建体的检测过程（固定，染色，洗涤等等）是相似的。 C.对照和测试构建体对靶PTM的影响，即PTM阳性细胞核的数量占所有转染细胞核的百分比。测试值小于对照构建体，表明测试构建体特异性地降低了目标PTM。 D.使用相对频率替代显示对照和测试构建体对目标PTM的影响。将用pUBC-H3.3-CFP对照构建体转染的PTM阳性细胞核的频率设定为1，并且用pUBC-UBP12-CFP测试构建体转染的PTM阳性细胞核的频率相对于此被表达。运行良好的测试构建体（这里：pUBC-UBP12-CFP）应该影响靶PTM并因此导致相对强度< 1。

笔记

空气干燥后，幻灯片上可以看到白色的内容。以下步骤都在幻灯片上执行。确保液体覆盖白色内容。
幻灯片可以放在一个空的移液器吸头盒中，以保持湿润。
Image-iT TM TM FX信号增强子与Alexa Fluor 555缀合的山羊抗兔抗体在相同的试剂盒中。它不适用于活细胞。
一个带有一些水的空吸管尖端盒被用作潮湿的培养箱。
检查几次，以确保抗体溶液连续覆盖细胞核，如果不是，则添加更多抗体溶液。

食谱

渗透介质（新鲜制备）
10 mM MES（pH 5.7）
10mM MgCl 2 2/2 150μM乙酰丁香酮
Tris缓冲液
10 mM Tris-HCl（pH 7.5）（见配方3）
10mM Na 2 -EDTA
100 mM NaCl
1M Tris-HCl（pH 7.5）
在1升H 2 O中的121克Tris碱用37％的HCl调节pH值
LB01裂解缓冲液
15 mM Tris-HCl（pH 7.5）
2mM Na 2 -EDTA
0.5毫米精胺
80 mM KCl
20 mM NaCl
0.1％Triton X-100
PBS缓冲液
10mM磷酸钠（pH7.0）（见配方6）
143 mM NaCl
1M磷酸钠（pH 7.0）
5.77毫升1M NaH 2 PO 4水溶液 4.23ml 1M Na 2 HPO 4 4

致谢

N的种子。本氏烟草和含有病毒RNA沉默抑制因子p19的构建体由E.Savenkov（SLU，Uppsala）友情提供。该协议是从以下发表的论文开发的：Derkacheva et al。（2016）。这项工作得到了Knut-and-Alice-Wallenberg基金会的资助。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

Derkacheva，M.，Liu，S.，Figueiredo，DD，Gentry，M.，Mozgova，I.，Nanni，P.，Tang，M.，Mannervik，M.，Kohler，C。和Hennig，L。）。 H2A去泛素化酶UBP12 / 13是拟南芥Polycomb组蛋白质系统的一部分。 Nat植物 2：16126。