材料和试剂

棉花涂药器，无菌（CARLO ERBA试剂，目录号：9.413 161）
30 G x½英寸针（BD，目录号：305106）
2 ml滑动尖端注射器（BD，目录号：302204）
BD INTRAMEDIC TM PE 50（BD，目录号：B427411）
培养皿，Falcon 50×9mm无菌培养皿（Corning，Falcon ，产品目录号：351006）
P200枪头（SARSTEDT，目录号：70.760.002）
Eppendorf管体积1.5 ml（Sigma-Aldrich，目录号：T9661-1000EA）
制造商：Eppendorf，产品目录号：022363204。
硅胶管适配器（2Biological Instruments，目录号：SFM3-1550）
1毫升注射器25 G针（Ettore Pasquali，目录号：11.3500.05）
Suture Dermalon 5/0 19 MM（Covidien，目录号：1756-21）
胶原酶P（Roche Diagnostics，目录号：11213865001）
Betadine（MEDA PHARMA SpA，Farmacie Coli，产品目录号：023907076）
Avertin（Sigma-Aldrich，目录号：T48402）
氯化钠（（NaCl）（CARLO ERBA试剂，目录号：FC72101100000）
酮洛芬（PFIZER ITALIA Srl DIV.VET）
RPMI 1640培养基（Lonza，目录号：12-167F）
L-谷氨酰胺（Lonza，目录号：17-605E）
HEPES缓冲液（Lonza，目录号：17-737E）
Pen-Strep（Lonza，目录号：17-602E）
胎牛血清（Euroclone，目录号：ECS0180L）
Hank平衡盐溶液（HBSS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：14175079）
氯化钙二水合物（CaCl 2•2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C5080）
Histopaque-1077（Sigma-Aldrich，目录号：H8889）
RPMI /谷氨酰胺/ HEPES / Pen-Strep / FBS（见食谱）
HBSS / Ca / HEPES（见食谱）

设备

镊子（Graefe镊子，100毫米，弯曲（ProSciTech，产品目录号：T131C），镊子，样式3（ProSciTech，产品目录号：T03-212）
剪刀（ProSciTech，产品目录号：TS103-200SB）
外科剃须刀（2Biological Instruments，目录号：2BTOSRC）
Cautery（全球医疗解决方案，目录号：BAA00）
恒温浴（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：TSGP02）
倒置显微镜（紧凑型，模块化立体声，徕卡，型号：Leica M60）
培养箱在37℃，5％CO 2，相对湿度环境至80％[例如，Series II 3110 Water-Jacketed CO 2 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Forma TM II 3110系列）]
Pipetman P20 / P200 / P1000（吉尔森）
微量注射器25μl汉密尔顿注射器（汉密尔顿，目录号：80401）
加热垫25 x 40厘米，两个温度范围（2Biological Instruments，LCPH）
Herasafe KS，具有UV表面消毒辐射器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Herasafe TM KS II，目录号：51022481）的II类生物安全柜。 />

软件

棱镜软件（GraphPad，美国）

程序

移植胰岛的制备

使用适当的方案分离胰岛（Graham et al。，2016）
1. 简而言之，通过颈椎脱臼牺牲动物，打开小鼠腹腔并切开腹膜。
2. 将3毫升胶原酶P放入带有30克针的2毫升滑动尖端注射器中。执行胆管注射程序并解剖膨胀的胰腺，注意不要切断胃，肠或其他腹部器官。
3. 将膨胀的胰脏倒入冰上的收集管中。当所有的胰腺都被切除后，在37℃的水浴中孵育15分钟。尽可能快地加入冰冷的HBSS / Ca / HEPES以停止消化过程。通过剧烈摇动管子来破坏胰脏。
4. 获得消化的组织后，胰岛通过密度梯度分离，从梯度界面回收，用RPMI 10％FBS洗涤并收集在含有30ml RPMI 10％FBS的50ml Falcon管中。
  注意：含有血清的RPMI在小鼠胰岛中维持（或者甚至增加）葡萄糖刺激的胰岛素分泌（Andersson，1978）。
之后，将5毫升胰岛转移到培养皿中，轻轻旋转以收集中心的胰岛。
在倒置显微镜下，用P200无菌吸头吸取健康的胰岛。在没有黑暗中心的情况下，健康的胰岛有光滑的边界（图1）。目测胰岛可以提供有关健康的基本信息。然后将挑选的健康胰岛转移到含有3ml新鲜的RPMI 10％FBS的新培养皿中。
预计使用一个培养皿将整个小岛注入一只小鼠。

图1.胰岛的图像手工采摘前分离的胰岛（A）。手工采摘后纯化的小岛（B）。比例尺表示150微米。
由于物理和化学处理，孤立的小岛受到高度压力。为了改善整体胰岛生存力，将在培养皿中培养的胰岛在37℃，5％CO 2的培养箱中静置过夜。这可以更好地区分死亡和活着的胰岛以及最佳的胰岛恢复。如果需要在胰岛采集当天进行移植，由于实验要求，将健康胰岛直接放入装有1ml无菌RPMI 10％FBS的1.5ml Eppendorf管中并保持在冰上直至移植。第二天在显微镜下检查胰岛以确认活力。如果需要的话，重新收集健康的胰岛，留下死细胞。然后将健康的胰岛从每个培养皿转移到含有1ml新鲜无菌RPMI 10％FBS的无菌1.5ml Eppendorf管中（图2）。

图2.胰岛的收集和制备。用P200（A）收集转移到培养皿中的健康胰岛并转移到无菌1.5ml Eppendorf管（B）中。
取决于所需的实验条件或使用的小鼠品系（例如，化学诱导的或自发性糖尿病，C57BL / 6），将被移植到肾囊下的手工采集的胰岛的数目从300变化到600或NOD，转基因或敲除）（Battaglia等人，2006; Gagliani等人，2011和2015; Fousteri等人，， 2015a和2015b）（见表1）。

表1.在不同小鼠模型中达到血糖正常所需的胰岛数目

在肾囊下移植
1. 所有使用的仪器和试剂必须是无菌的。理想的移植接受者应该在6至10周之间。
2. 受体小鼠通过腹膜内注射重量调整剂量的阿佛丁（240mg / kg）麻醉。
  注：Avertin是一种速效非药物级麻醉剂，用于小鼠的短期外科手术。它提供了快速和深度的麻醉，随后快速和完全的术后恢复。该代理被列入意大利卫生部批准的“动物规程”，程序由经过适当培训的人员执行。遵循所有准备和储存阿佛丁的指导原则。
3. 麻醉水平可以通过捏动物的脚趾来测试。用生理盐水溶液，0.9％NaCl保持小鼠眼睛持续湿润，直到小鼠醒来以防止角膜干燥。
4. 当麻醉起作用时，胰岛准备移植。在1.5ml Eppendorf管中沉降（通过重力作用）的所有胰岛被转移到25μlHamilton注射器中，该注射器使用螺旋机构连接到P200尖端，从而允许缓慢较少的剧烈抽吸。将硅胶管适配器放在注射器尖端上。将PE50管插入硅胶适配器。将Hamilton注射器转到对面，让胰岛进入PE 50管。小心不要丢失尖端边缘的小岛（视频1和图3）。
  
  图3.使用汉密尔顿注射器收集胰岛采用Hamilton注射器将胰岛收集到P200吸头（A）中，然后移入PE 50管（B）。
  
  视频1
5. 当鼠标处于麻醉状态时，将移植区域用电动剪刀剃光并用betadine消毒（视频2）。
  
  视频2
6. 用手指局部放置肾脏，并在左侧背部的皮肤上做一个1-1.5厘米的切口，以观察腹膜。在腹膜上做0.5-1厘米的切口以暴露肾脏。在切口的两侧施加轻微的压力，以允许肾脏滑出腹腔。使用浸泡过的棉签涂抹器保持暴露的肾脏表面用无菌盐水湿润。根据需要重复多次润湿以防止肾囊变干（视频3）。
  
  视频3
7. 使用注射器25号针在肾胶囊的右侧面上做小刮擦，以允许插入填充有胰岛并连接到汉密尔顿注射器的PE50。到达胶囊的后端并通过移动PE50管小心地创建一些空间并缓慢注入胰岛。一旦注入了所有的胰岛，请小心地取出PE50管，将该区域烘干并烧灼。
  注意：强烈建议使用新的PE50试管来移植每组胰岛，以避免血液凝结。（视频4和图4）。
  
  图4.肾囊下的胰岛。胰岛（白色）位于肾包膜下。比例尺代表3毫米。
  
  视频4
8. 然后将肾脏放回空腔中并用生理溶液清洁残余的血液。根据切口的大小（视频5和图5），用3或4针缝合两个切口（腹膜和皮肤）。
  
  图5.手术缝
  
  视频5
9. 用酮洛芬（5mg / kg）皮下处理小鼠并置于加热垫上。动物应保持温暖直至从麻醉中恢复，并且必须进行监测直至保持直立姿势和正常行走。
  24小时后血糖水平通常恢复正常

数据分析

在胰岛移植中，根据移植模型使用血糖水平来定义胰岛植入，存活，排斥和耐受的结果。胰岛移植通常被定义为实现血糖量正常，而移植排斥则是由高血糖的随后发展定义的。无论在同基因型还是异基因型模型中，胰岛移植失败都应定义为无法达到非空腹血糖水平250毫克/分升或在胰岛移植后7天内死亡（即，，手术死亡）。（Cantarelli et。，2013）
几项基于药物的治疗（Gagliani等人，2011）以及基于调节性细胞的治疗已证明其在建立长期耐受同种异体小鼠胰岛移植中的功效。为了测试活性状态的耐受性的发展并放弃治疗的小鼠免疫受到抑制的可能性，在移植后100天不排斥移植的小鼠（在两次连续的葡萄糖测量后考虑移植排斥，值> 250mg / dl ）通常用供体来源的脾细胞在体内加强。腹膜内（i.p.）注射从原始胰岛供体分离的总共30×10 6脾细胞，然后每日监测血糖水平。
小鼠血糖升高30-50天仍然具有正常血糖水平，对同种异体胰岛具有长期耐受性（Gagliani et al。，2011）。
统计分析
通常通过Kaplan-Meier存活曲线确定同种异体胰岛移植物的存活率，并使用logrank测试进行比较。 Prism软件（GraphPad，USA）用于所有分析（Fousteri et。，2015b）。当进行多重比较时，事后比较使用方差分析和Bonferroni校正。对于两组比较，使用不成对的双尾测验。在所有情况下，双尾 P 值< 0.05被认为是显着的（Battaglia等人，2006）。

食谱

RPMI /谷氨酰胺/ HEPES / Pen-Strep / FBS
500毫升RPMI 1640（RPMI）
5毫升L-谷氨酰胺
5毫升HEPES缓冲液
5毫升Pen-Strep
50毫升胎牛血清
将所有试剂组合在无菌生物安全柜中
在4°C储存
HBSS / Ca / HEPES
1克Hank平衡盐溶液（HBSS）
2 mM CaCl 2 2/2 20 mM HEPES
将所有试剂组合在无菌生物安全柜中
在4°C储存

致谢

自从该实验室成员首次发表以来，该协议已被使用（Battaglia et al。 2006年），并由Gregori及其同事（Gregori et al。，2005）。
使用小鼠的实验经批准并严格按照Ospedale San Raffaele动物护理和使用委员会的指导原则进行并传达给卫生部。我们要感谢小组成员的支持。该方案通常用于优化1型糖尿病的野生型或转基因小鼠模型中的移植后治疗策略的研究（Battaglia等人，2006; Gagliani等人，，2011年和2015年; Fousteri et al。，2015a和2015b）。没有披露任何潜在的利益冲突。

参考

Andersson，A。（1978）。培养物中分离的小鼠胰岛：血清和不同培养基对胰岛素产生的影响< / a> Diabetologia 14（6）：397-404。
Battaglia，M.，Stabilini，A.，Draghici，E.，Gregori，S.，Mocchetti，C.，Bonifacio，E.和Roncarolo，M.G。（2006）。雷帕霉素和白细胞介素-10治疗诱导介导抗原特异性移植耐受的T调节1型细胞。 / a> Diabetes 55（1）：40-49。
Cantarelli，E.，Citro，A.，Marzorati，S.，Melzi，R.，Scavini，M.和Piemonti，L.（2013）。临床前胰岛移植的小鼠动物模型：没有模型适合所有人（研究目的）。胰岛 5（2）：79-86。
Cantarelli，E.和Piemonti，L.（2011）。替代胰岛移植的移植位置 Curr Diab Rep 11（5）：364-374。
Fousteri，G.，Jofra，T.，Di Fonte，R.和Battaglia，M.（2015a）。抗原特异性治疗和免疫调节治疗联合应用可同时阻断非复发性自身免疫和同种异体反应性，肥胖的糖尿病小鼠。 PLoS One 10（6）：e0127631。
Fousteri，G.，Jofra，T.，Di Fonte，R.，Gagliani，N.，Morsiani，C.，Stabilini，A。和Battaglia，M.（2015b）。缺乏蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN22可增强移植对小鼠胰岛的耐受性 Diabetologia 58（6）：1319-1328。
Gagliani，N.，Gregori，S.，Jofra，T.，Valle，A.，Stabilini，A.，Rothstein，D.M.，Atkinson，M.，Roncarolo，M.G.和Battaglia，M.（2011）。雷帕霉素与抗CD45RB mAb和IL-10或与G-CSF联合诱导严格的耐受小鼠胰岛移植模型。 PLoS One 6（12）：e28434。
Gagliani，N.，Jofra，T.，Posgai，A.L.，Atkinson，M.A。和Battaglia，M。（2015）。与异体胰岛组合的免疫耗竭可永久恢复糖尿病NOD小鼠对自身抗原的耐受性。 PLoS One 10（11）：e0142318。
Graham，K.L.，Fynch，S.，Papas，E.G.，Tan，C.，Kay，T.W。和Thomas，H.E。（2016）。从小鼠胰腺分离和培养朗格汉斯胰岛 Bio-protocol 6（12）：e1840。
Gregori S，Mangia P，Bacchetta R，Tresoldi E，Kolbinger F，Traversari C，Carballido JM，de Vries JE，KorthäuerU，Roncarolo MG。（2005年）。抗CD45RO / RB单克隆抗体通过诱导凋亡和产生调节性T细胞。 J Exp Med 201（8）：1293-305。