第一部分：Flight protocol

材料和试剂

大约22 x 18 x 5厘米的塑料托盘
其外侧用Whatman滤纸（GE Healthcare，目录号：1001-918）覆盖约9cm直径的培养皿（Fisher Scientific，目录号：12033333;制造商：Pyrex，目录号：1480 / 08D））
系绳由直径0.2厘米的不锈钢棒制成（直径0.01厘米）（图1B）
约10×6×5厘米的聚苯乙烯泡沫
一个载玻片（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：3011-002）
圆形合成毛刷，4号（Camlin，66系列，4号）
飞行株需要进行任何性别测试，年龄3-4天
冰
透明指甲油

设备

宽视场显微镜（奥林巴斯，型号：SZX9）
定时器/秒表（Fisher Scientific，产品目录号：S02272）
用于冷麻醉的空玻璃瓶
温度控制（〜25°C）和湿度（〜60％）的行为室
JVC彩色摄像机 - 型号TK-C1481BEG（JVCKENWOOD，型号：TK-C1481BEG）

软件

Origin 8.0软件（MicroCal，Origin Lab，Northampton，MA，USA）
Streampix数字录像软件

程序

将培养皿放入盛有冰块的塑料托盘中。确保滤纸边缘不接触冰块（图1F）。

在将蝇蛆进行麻醉之前，将培养皿放在冰上10分钟
将5-6只任何性别的苍蝇加入空瓶中。通过在敲击垫上用苍蝇拍打小瓶将苍蝇转移到空小瓶中，使得苍蝇远离棉塞并位于小瓶的底部。攻丝后，取下塞子，将瓶子迅速倒入新鲜空瓶中，用力敲击以便将所有苍蝇转移到空瓶中，立即用另一个棉塞塞住，以防止苍蝇逸出（图1C）。通过将小瓶保持在冰中5分钟来使空瓶中的苍蝇麻醉（图1D）。
1分钟后用苍蝇轻轻敲打空的小瓶，并确保所有苍蝇都在小瓶的底部。一旦麻醉，所有的苍蝇都将不动，并将保留在小瓶的底部（图1E）。
一旦苍蝇被完全麻醉（5分钟内;重要的是苍蝇没有保存在冰上超过5分钟），轻轻地放置苍蝇与他们的背侧向上冷培养皿上的细刷（图1G）。
在室温下将一滴指甲油（约10μl）加到载玻片上，因为指甲油在预冷的载玻片上干得更快。
轻轻地将系绳（0.7-1毫米）的尖端浸在指甲油滴上，在系绳的尖端取一小滴（〜1-2μl）。
用左手的细刷，轻轻地将苍蝇放在腹部的翅膀上方，并将系绳保持在右手中。轻轻地将系绳放在脖子上，使指甲油滴落在头部的后部和胸部的前部。系绳的这个位置对于确保苍蝇的身体和头部不会倾斜很重要。如果正确连接，正常人将在5-15分钟之间飞行。重要的是，指甲油滴是最佳的尺寸，因为更大的水滴可能会覆盖胸部上的眼睛或感觉刷毛，从而影响飞行持续时间。作为批次最多只有5-10只苍蝇（视频1）。一旦每只小苍蝇被系住，将系绳固定在聚苯乙烯泡沫上（图1H和1I）。

视频1
一旦所有苍蝇从麻醉状态恢复（〜5分钟），用刷子轻轻地触碰腿部，以防止它们自发地飞行。准备好秒表，对所有苍蝇进行温和的吹嘴或自动吹气，然后立即打开秒表。观察批次中所有苍蝇的飞行持续时间（图1J和视频2）。

视频2
记下每次飞行停止飞行的时间。这是一次飞行的飞行时间。飞行时间可以通过手动或使用任何智能手机摄像头录制视频进行监控。我们使用JVC彩色摄像机 - 型号TK-C1481BEG和StreamPix数字视频录制软件来记录飞行视频。在后一种情况下，每次飞行的飞行时间可以从视频中记下。
每个基因型应至少测试30只苍蝇，每批5-10只。

备注：

在这个协议中，可以通过改变记录的持续时间来记录短暂的和长时间的飞行持续时间。为了测量短飞行时间，记录飞行时间30秒，而为了测量长时间飞行时间，根据需要将记录时间延长到15分钟/ 900秒或更长。大多数野生型（CS）苍蝇飞行超过5分钟。在苍蝇（实验基因型）严重飞行缺陷的情况下，它们将仅飞行几秒钟。在这种情况下，飞行时间可以测量30秒。
用于飞行测定的苍蝇在成年后不应暴露于CO麻醉下，

图1.共享。：一种。用滤纸覆盖的培养皿; B.具有尺寸的系绳; C.苍蝇转移到空瓶中进行冷麻醉; D.用冰块中的苍蝇将小瓶倒空; E.在空瓶中麻醉苍蝇; F.装满冰块的托盘保持陪替氏培养皿冷藏的安全性; G.麻醉苍蝇定位在陪替氏培养皿上; H.在评估飞行持续时间之前固定在聚苯乙烯泡沫上的拴系苍蝇; I.喷气之前受束缚的飞行刺激飞行; J.抽气后拴住苍蝇。＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;

数据分析

平均值，中位数和SEM计算每个基因型最少30只苍蝇。我们没有发现男性和女性的飞行能力和攀登能力之间存在显着差异。飞行持续时间被描绘为箱形图，其中使用Origin8.0软件（MicroCal，Origin Lab，Northampton，MA，USA）将单个苍蝇的平均值，中值和飞行持续时间覆盖在箱子上。
由于数据不符合正态分布，因此应用Mann Whitney U检验来评估样本之间的差异。

在表1中给出了30天广州S（野生型）苍蝇监测15分钟（900秒）的飞行持续时间，并且这些数据的代表性框图在图2中示出。

表1. 30天S-4天龄（野生型）任一性别苍蝇的飞行时间

图2. Canton S （野生型）苍蝇的飞行时间描绘为一个箱形图。实心方块表示分布的均值，方框表示分布的25-75％，空心菱形表示单个苍蝇的飞行持续时间。

第二部分：攀登协议

材料和试剂

直径2.5厘米的玻璃圆筒（硼硅酸盐玻璃量筒50毫升，直径2.5厘米），在离底部8厘米的高度有一个标记
苍蝇被测试适当的基因型和任何性别年龄3-4天

设备

定时器/秒表（Fischer Scientific目录号：S02272）
温度控制（〜25°C）和湿度（〜60％）的行为室

程序

应将新鲜封闭的任一性别的苍蝇收集在装有标准玉米粉培养基的小瓶中，每批10只，老化3-4天。
将一批10只苍蝇（非麻醉）转移到玻璃瓶中，方法是用撞击垫上的苍蝇拍打小瓶，立即取下棉塞，将苍蝇倒入玻璃瓶中，轻轻拍打，用新鲜棉布关闭瓶子插头。
让苍蝇适应3-4分钟的新环境。
准备好秒表，轻拍10次苍蝇量筒，轻轻确保所有苍蝇都到达圆筒底部，并立即开启秒表（视频3）。

视频3
计算在12秒内穿过8厘米标记的苍蝇数量。
在试验之间用相同的一组苍蝇重复实验两次，间隔为3-4分钟，并计算单批苍蝇的平均攀爬能力。一旦测定完成一种基因型，用干棉纸擦拭圆筒。一整套实验完成一天并让其干燥后，用水洗缸。确保不要使用肥皂，任何其他洗涤剂或乙醇进行清洁。
每个基因型至少应测试3批10只果蝇，每批测试3次。

数据分析

在12秒时间内跨过8cm标记的苍蝇的平均数可以作为条形图绘制，其中使用Origin 8.0软件（MicroCal，Origin Lab，Northampton，MA，USA）从最少3个独立批次的10只苍蝇计算SEM，美国）。大多数野生型/对照苍蝇在12秒内达到8厘米标记。条形图允许在各种基因型之间更容易可视化和比较。包装箱上重叠的单个批次值的箱子图也可用于表示这些数据。
使用单因素方差分析（ANOVA）计算不同基因型之间的统计学显着性（P <0.05） 0.05使用Origin 8.0软件（MicroCal，Origin Lab，Northampton，MA，USA）。
表2给出了 Canton S 苍蝇的攀登数据，同样的数据在图3中显示为条形图。

表2.野生型（ Canton S ）苍蝇攀爬测定的数据

图3.苍蝇攀爬能力（ S ）描绘为登山百分比。条形图表示在12秒内穿过8厘米标记的苍蝇百分比，误差线代表SEM，条上的空心菱形代表每批攀登者的平均百分比。

笔记

用于攀爬测定的圆柱体直径不应超过2.5厘米，因为更高直径的柱子也允许苍蝇在测定期间飞行和跳跃。

致谢

我们要感谢Santanu Banerjee，Sufia Sadaf和Tarjani Agrawal设立和即兴将飞行协议改为当前格式。我们还要感谢NCBS，TIFR的资助。这是2015年Agrawal和Hasan，Pathak等人，2015年和Richhariya等人于2017年发布的协议的一个修改版本。作者宣称没有竞争的经济利益。

参考

Agrawal，T。和Hasan，G。（2015）。果蝇中央大脑飞行电路的成熟需要Fz2 / Ca < sup> 2 + 信号。 Elife 4。
Pathak，T.，Agrawal，T.，Richhariya，S.，Sadaf，S.and Hasan，G。（2015）。通过orai进行商店营业的钙进入是为了在果蝇的飞行线路转录成熟所必需的。 J Neurosci 35（40）：13784-13799。
Richhariya，S.，Jayakumar，S.，Abruzzi，K.，Rosbash，M.和Hasan，G。（2017）。蛹转录组筛选将Ral识别为商店操作的钙进入目标果蝇 neurons。 Sci Rep 7：42586.