材料和试剂

大肠杆菌（大肠杆菌）隔离UTI893
无菌蒸馏的去离子水（二H 2 O）
琼脂糖，分子生物学级，标准筛
溴化乙锭，在蒸馏的去离子水（diH 2 O）中1mg/ml（或其它试剂以显现DNA）
具有10x NH 4缓冲液（APEX Bioresearch Products，目录号：42-409）的Taq聚合酶（1U /μl）
10mM dNTP混合物，PCR级（Life Technologies，目录号：18427-013）
胰蛋白酶
酵母提取物
NaCl
Tris碱
硼酸
EDTA（pH 8.0）
SDS
甘油
二甲苯蓝
溴酚蓝
hyxR相特异性引物，100μM储备液[Integrated DNA Technologies（IDT）]
5'-ACTGATAATAACCAGAGGCTTCTT-3'
5'-CAGTGATTAACTTTCGAACATATTG-3'
5' - GCGAAAGTTAATCACTGGTATGACC-3'
Tris-Borate-EDTA（TBE）（10x stock）（参见配方）
10x DNA加载染料（参见配方）
Luria-Bertani肉汤（LB）培养基（Sigma-Aldrich，目录号：L3022-250G（参见Recipes））
2％TBE琼脂糖凝胶（含EtBr）（见配方）
20ml 10×DNA加载染料6（二甲苯蓝/溴酚蓝）（参见配方）

设备

程序

笔记

UTI89是从膀胱炎的成年患者获得的原型ExPEC膀胱炎分离株，并且已经在文献中充分描述（Mulvey，1998）。该方案的引物设计为UTI89基因组序列，而ExPEC分离物是相似的，它们的基因组序列可能不是精确的。建议研究人员检查本协议中列出的引物是否能与其他ExPEC分离株一起使用
使用由Genesse Scientific，Inc（San Diego，California，USA）分配的APEX Taq聚合酶和伴随的缓冲液进行所有PCR反应。热循环仪参数基于制造商的建议。预期Taq聚合酶或相关的热稳定聚合酶在该测定中提供类似的性能，对反应进行少量修改
1x TBE是用来制作琼脂糖凝胶以及用于运行凝胶的缓冲液
任何市售的DNA加载染料是合适的。给出的食谱只是一个自制的建议。其他配方可使用不同的跟踪染料和/或密度剂

食谱

1x LB
在1升蒸馏水中悬浮20克在121℃下高压灭菌15分钟
组分（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L）的最终浓度
1L 10×TBE缓冲液储液（Tris-硼酸盐-EDTA） 108克Tris碱
55克硼酸
40ml 0.5M EDTA（pH 8.0）
diH 2 O至1L
搅拌至完全溶解
1 L 1x TBE缓冲区（工作）（注3）
100 ml 10x TBE
900ml diH 2 O v/v 混合良好
2％TBE琼脂糖凝胶，用EtBr
2 g琼脂糖/100 ml 1x TBE
在微波（约2分钟）中加热直到琼脂糖溶解
让在室温下放置15-20分钟冷却（你不想重新凝固）
在倾倒凝胶之前，加入EtBr至终浓度为0.1μg/ml
20ml 10×DNA加样染料（注4）（二甲苯蓝/溴酚蓝）
加入0.025g二甲苯蓝和溴酚蓝
1.25ml 10％SDS
12.5ml 100％甘油 6.25ml H 2 O x / 充分混合并在室温下贮存

致谢

该协议改编自Bateman和Seed（2012）。

参考文献

Bateman，S.L.和Seed，P.C。（2012）。由肠外致病性大肠杆菌产生的亚硝化应激反应和细胞内巨噬细胞存活的表观遗传调节 Mol Microbiol 83（5）：908-925。
Mulvey，M.A.，Lopez-Boado，Y.S.，Wilson，C.L.，Roth，R.，Parks，W.C.，Heuser，J.and Hultgren，S.J。（1998）。通过1型piliated uropathogenic大肠杆菌诱导和逃避宿主防御。 Science 282（5393）：1494-1497。