材料和试剂

移液器（Corning，Costar ®，目录号：4101）
接种循环
培养皿（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：101IRR）
没有针头的注射器（B. Braun Melsungen，目录号：4645103C）
手术刀
尼龙网孔，孔径40微米（无菌细胞过滤器，康宁，目录号：431750）
10毫升试管（Corning，Axygen ，目录号：SCT-10ML）
根癌土壤杆菌菌株GV3101（Mohamed等人，2004;菌株可在植物生理学研究所的集合中获得，并可提供给研究人员进行实验） >
烟草（Nicotiana benthamiana）（Sheludko等人，2007年;种子可在植物生理学研究所收集并可提供给研究人员进行实验）
LB培养基（MP Biomedicals，目录号：113002042）
利福平（Fisher Scientific，目录号：BP26791）
庆大霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15750060）
卡那霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11815024）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
Tris-HCl，pH 7.0（Roche Diagnostics，目录号：10812846001）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：C1016）
Acetosyringone（Abcam，目录号：ab146533）
MES（Sigma-Aldrich，目录号：69892）
硫酸镁七水合物（MgSO 4•7H 2 O）（Merck，目录号：1058860500）
氯化钙二水合物（CaCl 2•2H 2 O）（AMRESCO，目录号：0556-500G）
磷酸二氢铵（NH4H2PO4）（Sigma-Aldrich，目录号：A3048）
山梨醇（Sigma-Aldrich，目录号：S1876）
氢氧化钾（KOH）（AppliChem，目录号：211514）
纤维素酶Onozuka R10（近畿养乐多）
果胶酶Macerozyme R10（近畿养乐多）
Driselase（Sigma-Aldrich，目录号：D9515）
硝酸钙四水合物（Са（N°3）2•4H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C2786）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Fisher Scientific，目录号：P285）
硫酸镁（MgSO 4）（Acros Organics，目录号：AC413485000）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
三氯化铁（Fluor III）（Sigma-Aldrich，目录号：157740）
MS培养基（Sigma-Aldrich，目录号：M5519）
蔗糖（MP Biomedicals，目录号：04802536）
解决方案1（见食谱）
解决方案2（请参阅食谱）
解决方案3（请参阅食谱）
解决方案4（请参阅食谱）
解决方案5（请参阅食谱）
Knop的解决方案（见食谱）
农业浸润缓冲液（见食谱）

设备

培养箱振荡器（Biosan，型号：ES-20，目录号：BS-010111-AAA）
离心机（Eppendorf）
Transilluminator（Vilber，型号：ETX-F26.M，目录号：Vilber Lourmat 2131 2600 1）
装备有数字照相机（ZEISS，型号：AxioCam MRc5）的显微镜Axio Imager Z2（ZEISS，型号：Axio Imager Z2），38号滤光片套装（38 Endow GFP无换色（EX BP 470nm / 40nm，BS FT 495nm ，EM BP 525nm / 50nm），ZEISS，目录号：000000-1031-346）和模块ApoTome（蔡司，型号：ApoTome）

软件

ZEN，AxioVision 4.8（蔡司）

程序

对于该协议，我们使用植物表达载体，其中前导序列信号序列提供其在植物细胞的各种区室中的定位。根据前述程序（Tyurin等人，2017）获得载体。

A的培养，改造和选择。癌农杆菌
1. 使用接种环在含有利福平（50μg/ ml），庆大霉素（25μg/ ml）和羧苄青霉素（50μg/ ml）的5ml LB培养基中的根瘤农杆菌菌株GV3101菌株的种子细胞。 ml）（抗生素不影响植物转化的效率），并在摇床（〜140pm）中在28℃下过夜生长。
2. 将细菌培养物转移至95ml不含抗生素的LB培养基中，并在振荡培养箱（〜140μm）中在28℃下生长至OD 600 = 0.5-0.6的光密度。 >
3. 在室温下，将细胞在3,500×g下离心5分钟。
  在20毫升冷（0°C）溶液1中重新悬浮沉淀（请参阅食谱）。
4. 在室温下，将细胞在3,500×g下离心5分钟。
  2毫升溶液2重新悬浮颗粒（见食谱）。
5. 应该使用感应细胞进行转化。
6. 向感受态细胞中加入1μg表达载体（具有卡那霉素抗性基因）。在冰上孵育细胞20分钟。在振荡培养箱中于37℃加热溶液5分钟。将细胞放置在冰上5分钟，加入2毫升不含抗生素的LB培养基，并在振荡培养箱（〜140rpm）中于28℃孵育2小时。
7. 在含有50μg/ ml选择性抗生素卡那霉素（使用制造商推荐浓度的合适选择剂）的培养基中，将培养皿中的细胞转化到培养皿中。分离菌落并将细胞重悬于100-150μl不含抗生素的LB培养基中，然后冷冻它们。
植物材料
使用Knop's溶液在20±2℃下培养本氏烟草，光周期为8小时，光照为100μmol量/（m 2 s）（见食谱）作为6周的营养培养基。使用频率：每周2次。
N的农业渗滤。本生烟草植物
1. 解冻冻结 A。在含有利福平（50μg/ ml），庆大霉素（25μg/ ml）和羧苄青霉素（50μg/ ml）的LB培养基中于27℃下在摇床培养箱中培养48小时（〜 140 pm）。用含有相同抗生素和溶液3的LB培养基替换培养基（见食谱）。将细胞培养至OD 600 = 0.8的光密度。
2. 在室温下将细胞在3000×g下离心5分钟。在农杆菌渗滤缓冲液中重悬沉淀（参见食谱）至光密度OD 600 = 2.4。
3. 将细胞渗入6周龄的N背根表皮。使用不带针头的注射器将本生叶叶片（图1）离开。
4. 使用ETX透照仪（Vilber Lourmat）通过在烟草叶中在312nm下表达具有desC-egfp杂合基因表达的区域，估计农杆菌渗入后第4天的转化质量。
  切割烟叶的高荧光区域进行原生质体提取（图2）。
  
  图1.农杆菌渗入N背根表皮的过程。使用不带针的注射器
  
  图2.农杆菌浸润的本氏烟叶中的GFP荧光。将携带GFP融合蛋白表达盒的农杆菌注射器渗入到N液中。本氏烟叶，并且在紫外光下渗入（dpi）后4天观察到GFP荧光。荧光场用虚线标出。比例尺= 20毫米。
原生质体分离
1. 使用前立即制备溶液4（参见食谱）进行细胞壁浸渍，并通过离心澄清。
2. 按照Nosov等人的方法，将具有荧光的叶片用于原生质体分离（2014）。用手术刀剁碎叶子（约500毫克）。加5毫升溶液4.
3. 在15°C振荡器（50 rpm）中分离原生质体12小时。
4. 通过尼龙网孔（孔径40μm）过滤原生质体悬浮液。将原生质体悬浮液转移到10ml离心管中，并在室温下以100×g离心5分钟。
5. 在10ml溶液5中重悬原生质体的沉淀并在室温下孵育5分钟，然后在100gxg离心5分钟，重复该程序两次。在1.5ml溶液5中重悬原生质球（参见食谱）。
原生质体成像
使用配有AxioCam MR数码相机和过滤器的Axio Imager Z2显微镜（ZEISS）（图3）对新鲜分离的原生质体进行靶蛋白区域成像。

图3.从农杆菌浸润的叶面积的细胞中分离的烟草原生质体中GFP融合蛋白的亚细胞定位分析结果。植物表达载体的瞬时基因表达，其中前导信号序列提供其在植物细胞的各种区室中的定位，表明GFP融合蛋白定位于叶绿体（i strong），内质网（ II ）和细胞质（ III ）。合并的图像（第一列）包括绿色通道（最后一列）和叶绿体自发荧光通道（中间列）。比例尺= 10微米。

数据分析

所有实验至少进行三次独立的重复，每次重复至少分析三次。为了确定转化是如何完成的，我们检查了农杆菌渗入叶中NGF的GFP荧光水平。本氏烟草在紫外线下。为了估计烟草原生质体中GFP融合蛋白的亚细胞定位，我们分析了大约100个原生质体，并且在至少80％的原生质体中目测确定了阳性瞬时基因表达。

笔记

该协议可以应用于其他植物物种（图4）。

图4. AgI-PrI技术在不同植物物种中的潜在应用（秋林等人，2017，补充数据）

食谱

解决方案1
150毫摩尔氯化钠
10毫摩尔Tris-HCl（pH 7.0）
解决方案2
20毫克氯化钙2
10毫摩尔Tris-HCl（pH 7.0）
解决方案3
20μM乙酰丁香酮
10 m MES
解决方案4
200mg / L MgSO 4•7H 2 O 100mg / L CaCl 2•2H 2 O 0 150mg / L NH 4 H 2 PO 4←>
0.4 M山梨醇
4毫克CaCl2
12.5毫克MES-KOH（pH 5.7）
1％纤维素酶Onozuka R10
0.15％果胶酶Macerozyme R10
0.4％Driselase
解决方案5
0.5山梨醇
2.5毫克氯化钙2
Knop的解决方案1 L
1 gСа（NО 3 ） 2
0.25克KH 2 / CrO 4/2 0.25克MgSO 4
0.125克KIl
0.0125克Férél3
农业过滤缓冲液
1x MS媒体
10 mM MES-KOH（pH 5.6）
2％蔗糖
200μM乙酰丁香酮

致谢

该协议已被改编自早期研究（Tyurin等人，2017年）。作者确认，与本出版物无关的已知利益冲突。

参考

Mohamed，Sh。，Boehm，R.，Binsfeld，P.C。和Schnabl，H。（2004）。通过农杆菌介导的两种高油酸向日葵（Helianthus annuus ）基因型评估和重要参数的优化。 Helia 27（40）：25-40。
Nosov，А. V.，Fomenkov，A.A.，Mamaeva，A.S.，Solovchenko，A.E。，Novikova，G.V。（2014）。 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷与荧光染料叠氮化物点击反应的额外视角来研究细胞周期和脱氧核糖核苷代谢。 Russ J Plant Physiol 61（6）：899-909。
Sheludko，Y.V，Sindarovska，Y.R.，Gerasymenko，I.M.，Bannikova，M.A。和Kuchuk，N.V。（2007）。比较几种 Nicotiana 物种作为高产量的主机农杆菌介导的瞬时表达。 Biotechnol Bioeng 6（3）：608-14。
Tyurin，A.A.，Kabardaeva，K.V.，Berestovoy，M.A。，Sidorchuk，Yu。 V.，A.Fomenkov，A.A.，Nosov，A.V.，Goldenkova-Pavlova，I.V.（2017）。简单可靠的瞬时基因表达系统用于特征信号序列和目标蛋白在植物细胞。 Russ J植物生理学 64（5）：672-679。