材料和试剂

培养皿直径10厘米（SARSTEDT，目录号：82.1473）
飞股票
染色体，布卢明顿股票中心号：
1118 （X，BL 6326）
W *; ppk-Gal4（X，3，BL 32079）
（X，3，BL，28997）
琼脂神户我（卡尔罗斯，目录编号：5210.4）
琼脂平板（见食谱）
飞食物（见食谱）
1. 琼脂（字符串）（GewürzmühleBrecht，Eggenstein，德国，目录号：00262）
2. 玉米粉（Davert，Newstartcenter，目录号：17080）
3. 大豆粉（Davert，Newstartcenter，目录号：46985）
4. 啤酒酵母（地面）（GewürzmühleBrecht，Eggenstein，德国，目录号：03462）
5. 麦芽糖浆（MeisterMarken - Ulmer Spatz，德国莱茵河畔宾根，目录号：728985）
6. 糖蜜（糖蜜）（Grafschafter Krautfabrik，Meckenheim，目录编号：01939）
7. 尼泊金（4-羟基苯甲酸甲酯）（Sigma-Aldrich，目录号：54752-1KG-F）
8. 丙酸（Carl Roth，目录号：6026.3）

设备

刷子（规格1，Boesner，型号：Da Vinci Nova Serie 1570，产品目录号：D15701）
镊子Dumont＃3（精细科学工具，目录号：11231-30）
相机Basler ace acA2040-25gc（Basler，目录号：105716）
立体镜ZEISS Stemi-2000C（Pulch und Lorenz，产品目录号：455053-0000-000）
制造商：ZEISS，型号：Stemi-2000C。
外部光源LED Schott KL 1500 LCD（Pulch und Lorenz，产品目录编号：150.200）
制造商：SCHOTT，型号：KL 1500 LCD。
热探针，定制（见下图，图1）：
1. 温度计Greisinger电子GTH1170（Conrad，目录号：100599-62）
2. Electrolube聚氨酯（Electrolube，目录号：UR5634RP250G）
3. 电子零件（参见补充材料）
温度控制装置和热探针设计：
原则上，如在几个其他研究中使用的商业上可获得的和精确的温控烙铁（Neely等人，2011; Tracey等人，2003; Zhong＆amp;等人，2012）应该提供足够的准确度来进行这种测定。在这里，我们设计了一个温度控制装置，以将温度精确地保持在46°C的恒定值（图1）。一个问题是当探头浸入琼脂平板上的水膜中时温度损失很高，导致幼虫的温度变低和变化。为了防止这种警告，设备必须非常快速地调节温度以保持先前设定的值。通过使用定制的温度控制器，以前已经开发并采用了一种这样的设计（Babcock等人，2009）。

图1.热探针设置和设计。 A-C。定制控制器用于通过连接探头设置温度。 D.温控热探头由二极管（Z型二极管或普通二极管）组成，一根导线缩短并成型为探头（朝左）。第二根导线连接到电子控制器，二极管密封并用聚氨酯树脂绝缘，以防止温度过高泄漏。通过将传感器焊接到用于外部温度监测的探头上，可以选择包含一个外部温度传感器（热电偶，例如Greisinger electronic GTH1170）。

对于我们的热探头设计，我们的内部车间采用了通用二极管（1N4001），或者采用Z型二极管作为加热元件。二极管由恒定且精确控制的直流电加热。正向电压与电流无关（保持恒定），但仅取决于二极管阻挡层的温度。这允许使用发生的电压来精确测量和调节阻挡层温度。
两个导电二极管线中的一个用作热探针，并且应该如下成形：类似于先前描述的尺寸和形状，将突出线缩短为4-5mm和1.6×0.9mm宽（Tracey等人，2003）。热探头的尖端应该是刮刀形的，不应该有尖锐的边缘。当尖端温度低于40°C时，接触幼虫不应引起滚动行为。它应该尽可能短（4-5毫米）以防止不必要的热量损失，并且在测量温度的顶端与二极管阻挡层之间存在大的温差。
＆NBSP;＆NBSP;电压测量和温度调节通过连接到第二个二极管线的适当电子系统（内置和定制编程）实现。它显示当前温度并调整二极管端的功率以保持所需的恒定温度。
提供精确的电路和框图，电子零件和自定义编程作为辅助材料。
热探针二极管的校准：
将绝缘二极管置于37℃水箱（〜1L带磁力搅拌器的瓶子中，用高精度参考温度计测量温度）。使用非常短的脉冲（2-10毫秒仅用于防止二极管的显着加热）来测量二极管阻挡层在37°C时的电压。在55°C下执行相同的正向电压测量。两个校准点之间的正向电压变化与温度线性相关，因此允许在该温度范围内使用二极管电压进行温度测量和控制。

软件

视频软件
1. Stream Pix6（Norpix Inc.，Montreal，Quebec，订购德国Rauscher GmbH，编号Streampix STP-6-S-STD）
2. Windows VLC媒体播放器（ www.videolan.org ）

程序

所有的飞行物保持在25℃和70％湿度下，在标准飞行食物上进行12小时黑暗/光照周期。在产蛋后（AEL）96小时（小时），使用3日龄幼虫进行所有实验。为了确保所有幼虫的年龄大致相同，产蛋时间限制在4-6小时。在25℃，70％湿度和12小时光照/ 12小时黑暗周期的标准飞行食物中提高实验杂交。
准备你的基因十字架前两天准备约。 20-30个处女和每个10-15个男性（如果你使用弱基因型更多）。 2天后，将苍蝇转移到新鲜食物瓶中，在25℃定时产卵4-6小时（图2A）。将成年果蝇转移到新鲜的小瓶中（在同一天或第二天进行另一轮分娩）。原始小瓶维持在25°C直到96±3小时AEL。所有的幼虫应该在第三龄期（L3）觅食阶段，并且还没有离开食物（图2B）。
注意：准确的分期很重要，因为120 h AEL后幼虫的伤害性反应会减少，这可能是由于向徘徊阶段过渡和蛹化准备所致。食物中幼虫的密度也会影响分期：太少的动物不能有效地处理食物，而幼虫过多会导致食物竞争，这两者都会影响发育进程，并会扩大幼虫种群的发育阶段。

图2.正确的分期和幼虫密度 A.所用瓶尺寸的合适胚胎数量的照片（4-6小时内放置约100-150个胚胎）。 B.在96小时AEL，幼虫应该已经很好地处理了食物，仍然处于觅食阶段。
通过拨打所需温度（通常为46°C）准备热探针，并等待稳定（5分钟）。
在2％琼脂平板上分配250μldH 2 O 2以形成薄水膜，其使动物能够自由爬行并且执行其滚动行为（图3C）。没有水，幼虫不能充分移动，不会显示一致的行为反应。
注意：水膜会随着时间蒸发而影响行为反应。每次检测后更换平板。该设置应放置在立体镜下的无振动环境中，因为振动会影响伤害性行为。

图3.琼脂表面上的幼虫转移和水膜。 A和B.通过使用刷子将10-20个阶段的3龄幼虫轻轻放置在10cm 2的琼脂平板上来制备测定。 C.为了保持一致的行为反应，一个0.25毫升的薄水膜（用于说明的彩色洋红色）是必要的。
通过在dH 2 O中洗涤来准备约20个分级幼虫以去除任何残留的食物，并使用刷子将它们轻轻地放在琼脂平板上（图3A和3B）。让动物适应至少1分钟。
将琼脂平板放入与相机连接的立体镜下的幼虫。使用avi格式（每秒25帧）使用安装的摄像头和捕捉软件（如，Streampix）开始录制视频，因此对热探针的反应可以通过视频离线分析（图4A和4B ）。

图4.热伤害感受设置A.热感受伤害测定需要立体镜，连接到相机和白光照明光源。 B.将幼虫置于新鲜配制的琼脂培养皿上，并使用热探针测试热伤害感受反应。
使用46°C热探头在腹部4-6处以45°角横向接触前向运动的幼虫（图5A和5B）。通常情况下，幼虫在不到10秒的时间内就会产生刻板滚动逃逸反应。保持热探针与幼虫直接接触至少10秒钟，或者直到它执行滚动行为。

图5.探头热定位的步骤A.示意图描述了如何将热探头侧向应用于腹部4-6节45°角。 B.实际视频的静止帧，显示热探针应接触动物的位置。
测试后直接取出动物，避免双重取样
停止录像并继续进行下一批动物或视频分析。对于每个实验，取样至少60个幼虫以获得足够的统计能力。

数据分析

使用媒体播放器（如，VLC媒体播放器（ https：// www。对于每个实验动物，通过计算热探针的第一次接触和第一次360°滚动开始之间的等待时间（以秒为单位）来分析对热探针的反应。您可以放慢播放速度以确保准确性。
注意：所有的行为实验应该是双盲的，随机的，以避免不必要的偏见。应该对热探针测定的基因型进行编码（例如数字或字母），并且实验者将适当的基因型代码分配给每个视频。第二个人不知道基因型和代码，理想地分析视频。
绘制显示响应潜伏期在1-9秒和> 10秒来可视化分布。
统计分析：这里测得的反应潜伏期的分布通常不符合正态性标准（即数据点的高斯分布），因为它们是不对称分布的。这通常排除了使用参数测试（例如，Student's t -test），它假定正常。为了比较两组，可以使用非参数Wilcoxon秩和检验。当比较两种以上基因型时，Kruskal-Wallis检验（Wilcoxon Rank-Sum检验的扩展）可以作为单因素方差分析（ANOVA）的非参数替代。两个测试都要求每个等级的动物数量（在这种情况下是每秒）。当比较两个以上的组时，必须考虑多重比较的修正。这应该通过执行适当的 post-hoc 测试完成，通常是邓恩的方法。 Kruskal-Wallis Test和Dunn's post-hoc比较可以用最常见的统计程序（例如，Origin Pro 9.0，SigmaPlot，Prism，R或类似的程序）来执行。在这种情况下，效果大小和统计功效不是很容易计算出来的。然而，根据文献资料和我们自己的经验，我们推荐使用n＆gt; 60个动物/基因型以确保足够的能力来统计评估生物学上有意义的差异。
预期结果（图6）
使用特定表达的破伤风毒素轻链（ ppk-Gal4 ; UAS-TnT ，视频1）使沉默C4da神经元与对照相比导致逃避反应的潜伏期显着增加（ ppkGal4 或 UAS-TnT ，视频2）。

图6.使用破伤风毒素轻链（TnT）沉默C4da神经元功能的典型实验结果。对于大多数对照动物（ ppk-Gal4 或 -TnT ），滚动响应的延迟小于10秒，而C4da神经元沉默（ ppk-Gal4 ，
视频1

视频2
使用基于二极管的热探头进行温度传输和测量，包括用于温度控制器的自定义编程（BASCOM）（参见补充材料）。

笔记

甚至在最终表现出伤害性滚动响应之前，动物将尝试避免接触并加速。采取一些练习来保持热探针与体壁接触10秒。练习使用非加热探头以确保在此过程中不会施加有害的机械刺激。然后练习对照动物，直到手动程序足够可靠。在热探针接触没有完全保持直到第一次滚动或最多10秒的情况下排除动物。

食谱

琼脂平板
注意：对于热伤害感受测定，使用2％琼脂平板。
将神户琼脂I溶解在dH 2 O中，并填充规定体积为12ml的培养皿（Ø10cm）
＆nbsp;飞行食物

1L标准飞行食品使用以下成分：

溶于1 L dH 2 O 0

致谢

这项工作得到LandesförschungsförderungLFF-FV27（至P.S.）和Deutsche Forschungsgemeinschaft优先计划SPP1926（项目SO1337 / 2-1至P.S.）的支持。作者要感谢几个研究团队在果蝇中开发和应用热伤害感受测定的工作和努力，特别是D. Tracey，M. Galko，C. Montell和G.的实验室。尼利。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

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