材料和试剂

使用细针（0.5×16mm / 25G×5/8“，Microlance 3，BD，目录号：300600）的1ml一次性注射器（Plastipak 1ml，BD，目录号：303172）
40 x 0.13 mm硼硅酸盐玻璃盖玻片（VWR，目录号：631-0177）
硅胶锥（flexiPERM锥形A，格瑞纳生物一国际）
在撰写本文时，只能通过Greiner的特殊订购电话进行交付，并且交货时间可以足够长，以使前瞻性计划变得重要。锥体可以重复使用多年。
注：我们知道没有合适的替代品。
100毫米无菌培养皿（用于解剖 - 表面质量无关紧要）（Cell Star ，Greiner Bio One International，目录号：664160）
60×15毫米无菌培养皿（Cell Star ，Greiner Bio One International，目录号：628160）
注意：我们使用Greiner，但期望别人也适合。
玻璃巴斯德吸液管（150毫米，沃拉克，目录号：D810）
在E11.5（E10.5也是合适的，但更具挑战性的解剖）定时交配老鼠。
无菌蒸馏水
100％甲醇
Eagle's最小基本培养基，含有Earle's盐和非必需氨基酸（Sigma-Aldrich，目录号：M5650）
胎牛血清（FBS）（Biochrom，目录号：S 0415）
青霉素 - 链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P4333）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：79382）
抗层粘连蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：L9393）
FITC抗兔（Sigma-Aldrich，目录号：F0382）
胚胎最大青霉素 - 链霉素溶液，100x（Sigma-Aldrich，目录号：TMS-AB2-C）
过氧化氢（Sigma-Aldrich，目录号：H1009）
氢氧化铵（Sigma-Aldrich，目录号：A6899）
清洁解决方案（见食谱）
解剖介质（见食谱）
培养基（见食谱）
水合缓冲液（见食谱）

设备

镊子
手术刀（弯曲刀片，例如，D型，22型，Swann Morton，目录号：0108）
80°C烤箱
注意：我们使用1号Gallenkamp Hotbox，但任何80°C的烤箱都应该是合适的。
细胞培养箱在37°C，5％CO 2
注意：我们使用NuAire 5500E（NuAire，型号：NU-5500E），但任何稳定的培养箱都应该能够正常工作。
解剖显微镜
注：我们使用ZEISS Stemi 2000C显微镜（ZEISS，型号：Stemi 2000-C）和透照阶段，但在其他实验室用其他解剖显微镜模型显示了该技术。显微镜的精确类型并不重要，但透照（而不是落射照明）是。
清洁区域
注：我们不使用安全柜（对于我们使用的非病原体感染的样本），因为风扇的振动是一个麻烦。我们确实使用与Perspex制造的安全柜尺寸相似的简易橱柜，以防止爱丁堡风吹过不合身古色古香的实验室窗户的灰尘。

程序

制备
1. 将解决方案列在“食谱”部分。
2. 消毒40×0.13毫米的盖玻片（取决于制造商，他们可能需要首先在1N HCl中进行酸处理;室温10分钟，然后在无菌蒸馏水中漂洗3次）。
3. 清洁溶液中的flexiPERM锥体（50毫升左右 - 确切的体积无关紧要）在70°C下10分钟。冲洗3次，并将其储存在无菌蒸馏水中。
分离E11.5小鼠肾衰竭
注意：每个怀孕的老鼠在熟练的手中花费大约20分钟，对于初学者来说，花费的时间要长得多。建议绝对的初学者首先分离E12.5肾脏，然后再转向难以看见的E11.5肾脏。所有步骤应在无菌条件下进行。
1. 根据当地的动物许可证和法律，牺牲怀孕的母鼠。
2. 去除子宫。
3. 在一个大的培养皿中，将子宫浸泡在解剖介质中，并用手术刀在子宫的凸起之间切割：在待切割的组织上“滚动”手术刀的弯曲边缘比以常规方式拉动手术更容易。用钳子将胚胎挤压出来。移除胚胎的头部，以及任何胎盘/膜材料。（图2）
  
  图2.E11.5后肾肾分离图。：一种。怀孕的子宫; B.用钳子将胚胎挤出子宫; C.提取的E11.5胚胎; D.胚胎的尾部; E.胚胎的后方，切成两半;箭头指向后肾，其边缘在细节上标记为白色（看到肾脏是解剖中最难的部分，并且需要练习）。 F.分离的E11.5后肾。 A-C的比例尺为5毫米，D和E为1毫米，F为0.5毫米。
4. 将胚胎移植到一个直径约5毫米的60毫米培养皿中，使用解剖介质（精确的数量可以根据个人喜好进行调整），可以在4°C下直接使用。
5. 使用细针作为解剖工具（详见材料和试剂），将胚胎横切至后肢芽。留下后肢芽的部分（这些可以存储几天或在冰上运输：见戴维斯，2006年，方法的细节）。
6. 删除尾巴（否则这是一个松懈的问题，同时解剖）
7. 将胚胎腹侧的每个后端碎片放下，并从神经管的中线直接向下切到腹面。
8. 检查在最后一步创建的每一半，从切割（解剖学中度）的表面，并确定（在E11.5）在后肢芽的头界限旁边的肾脏的雏形。肾管的输尿管芽憩室是最明显的空间线索，并且可以通过光散射特性的轻微改变来看到后肾间质的延伸（在一些显微镜上，它看起来比周围中胚层更轻，并且在一些上看起来更黑）。
9. 解剖胚胎的其余部分的肾脏，用一根针将组织固定下来，并将另一根针头靠在它上面以便精确切割，并将肾脏转移到一个新的盘子中，在盘子中可以汇集雏形以备后用（牵拉的玻璃杯移液器提供了一个简单的转移基础的方法：熔化玻璃的热量拉他们将消毒其末端）。
  注意：在整个解剖过程中，应注意确保介质不会长时间残留在空气中（介质中的pH指示剂会通过颜色变化显示出来），我们建议15分钟作为最大但是空气流动可能意味着需要更短的时间，根据我们的经验，HEPES抑制正常的肾脏发育，我们避免使用它）
塞宾格文化
1. 将盖玻片和硅胶锥体放入80°C的烘箱中20分钟晾干（干燥对硅胶锥和盖玻片之间的适当粘合是必不可少的）。他们可以戴着手套的手或镊子使用塑料镊子来避免使用金属可能导致的损伤。
2. 将一个锥形的窄端向下放在盖玻片上，用一个钝端的镊子将硅胶锥的边缘压在盖玻片上，以确保紧密粘附。
3. 将带有硅胶锥的盖玻片放在60毫米培养皿的底部。（图3）
  
  图3.赛宾格的培养方法A.显示培养体系的不同组成部分。 B.显示组装的赛宾格文化系统。
4. 吸取一个肾脏雏形到由锥体定义的玻璃圆圈的大致中心。
5. 为了避免组织变干的风险，应尽快吸除肾脏遗留的任何培养基，并将85μl培养基放入圆圈中。它可以直接从冷藏库中使用。使用移液器吸头确保这种介质扩散到覆盖整个由锥体包围的玻璃圆圈，并且不会“滴”成一个滴（图4）。请注意，最适量的介质会随着锥体的批次和玻璃的不同而略有变化。因此，我们建议用户用自己的材料尝试一系列的体积（，例如，80,82.5,85.97.5,90μl）以确定最佳效果。
6. 将60毫米培养皿（盖玻片，硅胶圆锥体和肾脏雏形现在里面）放到100毫米培养皿的底部，并加入3毫升水合缓冲液（当水合缓冲液与硅胶锥体将锥体从盖玻片上分离，并且系统变得泄漏，这就是为什么我们使用单独的碟子来添加水合缓冲液）。（图4）
  
  图4.圆锥和碗碟的排列：一种。在KCM培养基的少量培养基中，在硅胶圆锥体的中心培养肾脏原始成分，并在外部培养皿中加入增湿缓冲剂以防止干燥。 B. KCM倾向于作为一滴（左手侧图像），需要用枪头分布以覆盖由硅胶锥体（右侧图像）包围的玻璃环。
7. 将盖子放在100mm培养皿上，然后将培养皿置于组织培养培养箱（37℃，5％CO 2，100％湿度）中。肾脏可以培养3天;除此之外，更改媒体是可取的。如图1A所示，外周的一些细胞可以出来并在玻璃上形成单层，但是整个肾脏应保持完整和连贯。如果“四舍五入”，但仍然活着，可能中间太多了;如果它变成一团干的，那就太少了。
  注意：对于延时拍摄，我们推荐Etaluma的孵化器内显微镜。
8. 根据适用于任何抗体染色的方案，将标本固定在盖玻片上。除去培养基后，我们一般在-20°C下使用100％的甲醇，15分钟后使其升温至室温，然后用磷酸盐缓冲液洗涤。如果其他固定技术涉及洗涤剂（Tween，Triton等），应非常小心地更换溶液，以避免玻璃与培养物分离。在Bijou（5毫升）瓶中，抗体孵育通常在4℃过夜。用于图1中层粘连蛋白染色的实例方案是在4℃在PBS中的200μl1/100抗层粘连蛋白（Sigma-Aldrich）中过夜温育，在4℃下在PBS中7小时洗涤，过夜温育在4℃下在PBS中的200μl1/100 FITC抗兔（Sigma-Aldrich）中，在4℃在PBS中两次洗涤2次，然后在PBS或1： 1PBS-甘油，盖玻片与主玻片保持分离，盖玻片用作间隔物。这防止了组织的挤压。我们不嵌入或部分。

数据分析

这是一种文化的方法，而不是一个具体的测量方法，这种方法将支持一系列的问题和分析。但是，它的功能使其更适合于某些问题。为避免因个体差异造成的假阳性数据，如果要使用多于一只母鼠的胚胎，我们建议将所有胚胎的肾脏合并，然后随机分配给实验组和对照组。
该方法涉及的手工操作的程度使得器官雏形的最终尺寸和形状变化很大，并且一些根本不生长，这通常是因为如图4B左图所示，介质膜已经变成下降。至少，实验者需要解决一些排除标准，以便可以从分析中公平地排除失败的文化（理想的是，除了简单观察中等影片之外，在进行任何分析之前）。样本之间生长的变化，可能是由于样本在薄膜中的位置的细微差异而引起的，这意味着在实验和对照肾脏的任何有意义的比较之前，诸如总器官面积之类的特征的测量将产生大的误差条并且需要许多重复。我们建议不要使用这样的措施。更好的定量测量包括集合管树中分支尖端的数量和肾单位的数量。分支尖端计数分析的实例可以在Fisher等人（2001）和Michael等人（2005）中找到。即使如此，总是有一个模棱两可的问题：“T形”如何作为一个分支的终点必须被视为两个小窍门，而不是一个，而且对于什么是成熟的被称为肾单位，总是存在一些模棱两可的问题。因此，我们强烈建议所有的样本都是盲目编码的，或者如果这样做不实际，那么他们的图像是盲目编码的，并且由不知道样本是来自实验还是控制的人计数。
通过观察器官培养所获得的大量信息，无论是正常的还是受试验操作的，都是定性而不是定量的：管状形态是一个例子。同样，鼓励研究人员使用盲编码，也许使用由多个独立人员查看的图像，甚至可能使用半定量评分系统，甚至形态学（例如，将肾单位分类为“正常”或“异常”）。一些数据是关于方向的，例如Henle环路的增长方向。方向需要坐标系统。可以通过从例如肾的中心（例如，使用ImageJ的质量函数中心确定的）径向地延伸线或者从第一分支点径向延伸线来制作简单的坐标系。例如Henle的圈的方向可以根据圈的细管与通过其末端的径向线之间的角度来测量。同样，在相同的盲编码样本上进行多个生物学重复和多个人测量将提供观察者间变异性和样本间变异性的良好测量。

食谱

清洁解决方案
这由5：1：1（体积比）组成：H 2 O：H 2 O：2：NH 4 4 / sub > OH
通过在水中加入过氧化氢和氢氧化铵，而不是相反，在处理浓缩溶液时使用个人防护装备（手套，眼睛保护装置）。
解剖介质
根据生产商的说明，将Eagle's最小的基本培养基与厄尔氏盐和非必需氨基酸溶解在ddH 2 O中。
培养基：KCM
注意：只需在Eagle's培养基中加入血清和抗生素（解剖介质）即可。
解剖介质
10％胎牛血清
1/100青霉素/链霉素原液（该原液含有10.000U / ml青霉素和10mg / ml链霉素）
水化缓冲液
PBS（来自Sigma-Aldrich片剂：让片剂溶解一小时，并充分混合，然后加入从上述方法3中提到的从100x储液中稀释的青霉素/链霉素）。

致谢

这里描述的技术的开发和使用得到了以下的资助：欧盟委员会FP6资助MRTN-CT-2006-036097，医学研究委员会资助MR / K010735 / 1，肾脏研究英国资助RP_002_20160223，以及埃及教育和文化局的博士奖学金。该协议最初在Sebinger，2010年的方法部分进行了描述。作者没有竞争的兴趣。

参考

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