材料和试剂

载体构建和拟南芥转化
1. 移液器吸头（20μl，200μl，1,000μl和5ml吸头）
2. 1.5毫升微管
拟南芥叶绿体分离
1. 移液器吸头（20μl，200μl，1,000μl和5ml吸头）
2. 1.5毫升microtubes
3. 单刃剃须刀片
4. 塑料培养皿，直径150 x 15毫米，直径90 x 15毫米
5. 200μm尼龙网眼锥（Kyoshin Rikoh）
  注：100至120毫米的网格正方形被折叠成一个圆锥体并钉住以保持其形状（图1）。
  
  图1.制作200μm网状锥体的步骤
6. 原生质体破裂装置（图2）
  1. 10毫升一次性注射器（Terumo）
  2. 20μm尼龙网（Kyoshin Rikoh）
  3. 10μm尼龙网（Kyoshin Rikoh）
  4. 电工胶带，宽15-20毫米
  注意：切断注射器筒的末端，使其看起来像中空管（图2A）。将10微米网格放在20微米网格的顶部，并将其放在注射器的切割端上，使得10微米网格面向外部，并且20微米网格靠着注射器筒（图2B和2C）。使用电工胶带将网状物固定到位，使两层网状物保持在注射器的两侧，使网状物暴露在筒的末端（图2D）。
  
  图2.制备原生质体破裂装置的步骤A.切断注射器筒的末端。 B. 20μm网眼（左）和10μm网眼的注射器针筒。 C.制造原生质体破裂装置的示意图。 D.原生质体破裂装置的成品。
7. 巴斯德吸管
8. 拟南芥（加入哥伦比亚）
9. Murashige和Skoog植物盐混合物（Wako Pure Chemical Industries，目录号：392-00591）
10. 蔗糖（Wako Pure Chemical Industries，目录号：196-00015）
11. 2-吗啉代乙烷磺酸一水合物（MES）（DOJINDO，目录号：343-01621）
12. 琼脂（Wako Pure Chemical Industries，产品目录号：016-11875）
13. 氢氧化钾（KOH）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：168-21815）
14. 山梨醇（Sigma-Aldrich，目录号：S1876-1KG）
15. 氯化钙二水合物（CaCl 2•2H 2 O）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：031-00435）
16. 纤维素酶（Yakult）
17. Macerozyme（Yakult）
18. Percoll（GE Healthcare Life Sciences，目录号：17089101）
19. 1 H 2- [4-（2-羟乙基）-1-哌嗪基]乙磺酸（HEPES）-KOH，pH7.5和pH8.0（HEPES购自DOJINDO，目录号：342-01375）
  注意：用KOH调节HEPES缓冲液的pH值。
20. 氯化镁六水合物（MgCl 2•6H 2 O）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：135-00165）
  注：步骤B中使用1M氯化镁。
21. 氯化锰（II）四水合物（MnCl 2•4H 2 O）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：133-00725）
  注意：步骤B中使用1M氯化锰（II）。
22. 乙二胺四乙酸（EDTA）（DOJINDO，目录号：345-01865）
  注意：步骤B中使用0.5M EDTA。
23. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A3912-100G）
24. Tricine（DOJINDO，目录号：347-02844）
  注意：Tricine直接用于程序B.
25. （2-氨乙基）乙二醇-N，N，N'，N' - 四乙酸（EGTA）（DOJINDO，目录号：346- 01312）
26. 碳酸氢钠（NaHCO 3）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：191-01305）
27. 0.5倍Murashige和Skoog培养基（MS培养基）（见食谱）
28. 消化缓冲液（见食谱）
29. 消化酶缓冲液（见食谱）
30. 40％（v / v）AT Percoll（见食谱）
31. 85％（v / v）AT Percoll（见食谱）
32. 渐变缓冲区（见食谱）
33. 原生质体重悬缓冲液（见食谱）
34. 原生质体破损缓冲液（见食谱）
35. HEPES-山梨糖醇缓冲液，pH8.0（见食谱）
叶绿体分馏
1. 移液器吸头（20μl，200μl，1,000μl和5ml吸头）
2. 1.5毫升microtubes
3. 丙酮（Wako Pure Chemical Industries，目录号：016-00346）
  注意：步骤C中使用80％（v / v）丙酮。
4. 100％（w / v）三氯乙酸（TCA）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：208-08081）
5. 蔗糖（Wako Pure Chemical Industries，目录号：196-00015）
6. 氢氧化钾（KOH）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：168-21815）
7. 山梨醇（Sigma-Aldrich，目录号：S1876-1KG）
8. 乙二胺四乙酸（EDTA）（DOJINDO，目录号：345-01865）
  注：步骤C中使用0.5M EDTA。
9. Tricine（DOJINDO，目录号：347-02844）
  注意：在程序C中，为TE / DTT缓冲液制备1M Tricine-KOH，pH7.5。
10. 二硫苏糖醇（DTT）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：041-08976）
  注意：程序C中使用了1 M DTT
11. 核糖核酸转移（tRNA）（MP Biomedicals，产品目录号：0215653480）
12. 2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇（Tris）碱（Wako Pure Chemical Industries，目录号：207-06275）
  注意：步骤C中使用1M Tris。
13. 十二烷基硫酸钠（SDS）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：196-08675）
  注意：程序C中使用20％（w / v）SDS。
14. 甘油（Wako Pure Chemical Industries，目录号：075-00616）
  注：步骤C中使用50％（v / v）甘油。
15. 饱和溴酚蓝（Wako Pure Chemical Industries，目录号：029-02912）
16. 含有1,0.6,0.46,0.2和0M蔗糖的TE / DTT缓冲液（参见配方）
17. SDS样品缓冲液（见食谱）
胰蛋白酶处理完整的叶绿体
1. 移液器吸头（20μl，200μl，1,000μl和5ml吸头）
2. 山梨醇（Sigma-Aldrich，目录号：S1876-1KG）
3. 氯化钙二水合物（CaCl 2•2H 2 O）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：031-00435）
  注意：步骤D中使用1M氯化钙。
4. Percoll（GE Healthcare，目录号：17089101）
5. 1 H 2- [4-（2-羟乙基）-1-哌嗪基]乙磺酸（HEPES）-KOH，pH7.5和pH8.0（HEPES购自DOJINDO，目录号：342-01375）
  注意：用KOH调节1M HEPES缓冲液的pH。
6. 氯化镁六水合物（MgCl 2•6H 2 O）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：135-00165）
  注意：步骤D中使用1M氯化镁。
7. 乙二胺四乙酸（EDTA）（DOJINDO，目录号：345-01865）
  注意：步骤D中使用0.5M EDTA。
8. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A3912-100G）
9. 二硫苏糖醇（DTT）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：041-08976）
  注意：程序D中使用了1 M DTT
10. 2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇（Tris）碱（Wako Pure Chemical Industries，目录号：207-06275）
  注意：步骤D中使用1M Tris。
11. 十二烷基硫酸钠（SDS）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：196-08675）
  注意：程序D中使用了20％（w / v）的SDS。
12. 甘油（Wako Pure Chemical Industries，目录号：075-00616）
  注：步骤D中使用50％（v / v）甘油。
13. 饱和溴酚蓝（Wako Pure Chemical Industries，目录号：029-02912）
14. 胰蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：T1005）
  注意：步骤D中使用20mg / ml胰蛋白酶。
15. α-甲苯磺酰-L-赖氨酸氯甲基酮（TLCK）（Sigma-Aldrich，目录号：T7254-100MG）
  注：步骤D中使用50mg / ml TLCK。
16. 抑肽酶（Sigma-Aldrich，目录号：A3886-1VL）
  注：步骤D中使用2mg / ml抑肽酶。
17. 苯基甲磺酰氟（PMSF）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：164-12181）
  注意：步骤D中使用200mM PMSF。
18. 胰蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich，目录号：T6522-25MG）
  注：步骤D中使用10mg / ml胰蛋白酶抑制剂。
19. cOmplete TM TM，EDTA-FREE（Roche Diagnostics，目录号：11 873 580 001）
20. 40％（v / v）AT Percoll（见食谱）
21. SDS样品缓冲液（见食谱）
22. 2x胰蛋白酶缓冲液（见食谱）
23. 2个停止缓冲区（见食谱）
24. 1倍40％（v / v）Percoll（见食谱）
25. 1倍HEPES山梨糖醇缓冲液（见食谱）
26. SDS-cOmplete 缓冲液（见食谱）
碱性提取叶绿体
1. 移液器吸头（20μl，200μl，1,000μl和5ml吸头）
2. 丙酮（Wako Pure Chemical Industries，目录号：016-00346）
  注：步骤E中使用80％（v / v）丙酮。
3. 100％（w / v）三氯乙酸（TCA）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：208-08081）
4. 二硫苏糖醇（DTT）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：041-08976）
  注意：程序E中使用了1 M DTT
5. 核糖核酸转移（tRNA）（MP Biomedicals，产品目录号：0215653480）
6. 十二烷基硫酸钠（SDS）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：196-08675）
  注意：步骤E中使用20％（w / v）SDS。
7. 甘油（Wako Pure Chemical Industries，目录号：075-00616）
  注：步骤E中使用50％（v / v）甘油。
8. 饱和溴酚蓝（Wako Pure Chemical Industries，目录号：029-02912）
9. 碳酸钠（Na 2 CO 3），pH 12（Wako Pure Chemical Industries，目录号：199-01585）
  注意：步骤E中使用0.2M碳酸钠。
10. SDS-样品缓冲液（见食谱）
用于评估蛋白质浓度的斑点印迹分析
1. 移液器吸头（20μl，200μl，1,000μl和5ml吸头）
2. Whatman TM 3MM色谱纸（GE Healthcare，目录号：3030-917）
3. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A3912-100G）
4. 二硫苏糖醇（DTT）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：041-08976）
  注意：程序F中使用了1 M DTT
5. 2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇（Tris）碱（Wako Pure Chemical Industries，目录号：207-06275）
  注意：步骤F中使用1M Tris。
6. 20％（w / v）十二烷基硫酸钠（SDS）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：196-08675）
7. 甘油（Wako Pure Chemical Industries，目录号：075-00616）
  注：步骤F中使用50％（v / v）甘油。
8. 饱和溴酚蓝（Wako Pure Chemical Industries，目录号：029-02912）
9. 考马斯蓝R-250（Wako Pure Chemical Industries，目录号：031-17922）
10. 甲醇（Wako Pure Chemical Industries，目录号：139-01827）
11. 乙酸（Wako Pure Chemical Industries，目录号：017-00256）
12. 纸巾
13. SDS样品缓冲液（见食谱）
14. 考马斯蓝染色（见食谱）
15. 考马斯亮染液（见食谱）
数据分析
1. 抗蛋白质A的抗体（Sigma-Aldrich，目录号：P3775）（该抗体用于检测用蛋白A标记的嵌合转运蛋白）
2. 抗Rubisco的大亚基（LSU）（基质的标记蛋白）的抗体
3. 抗Tic的抗体（叶绿体内膜包膜上的转座子）110（内包膜的标记蛋白）
4. 抗捕光复合蛋白（LHCP）（类囊体膜的标志蛋白）的抗体
5. 抗Toc抗体（叶绿体外膜包裹的转座子）75（外包膜的标记蛋白）
注意：这四种抗体（40到43）是自制的或由其他科学家提供的。您可以使用针对叶绿体每个小分区的标记蛋白产生的商业抗体。

设备

载体构建和拟南芥转化
1. 移液器（Gilson，型号：P20，P200，P1000和P5000，目录号：F123600，F123601，F123602和F123603）
拟南芥叶绿体分离
1. 移液器（Gilson，型号：P20，P200，P1000和P5000，目录号：F123600，F123601，F123602和F123603）
2. 冰箱和冰柜
3. 生长室（16小时光照/ 8小时黑暗，70-120微米-2秒秒-1，22℃）。
4. 50毫升离心管（IWAKI）
5. 大容量离心机（TOMY SEIKO，型号：Suprema 23）
6. 摇摆转子（TOMY SEIKO，型号：TS-33N和B433）
7. 摇摆桶（TOMY SEIKO，型号：3350-G01P）
叶绿体分馏
1. 移液器（Gilson，型号：P20，P200，P1000和P5000，目录号：F123600，F123601，F123602和F123603）
2. 冰箱和冰柜
3. 均质机（IUCHI）
4. Optima TM TL超速离心机（Beckman Coulter）
5. 角转子（Beckman Coulter，型号：TLA-100.3，目录号：349490）
6. 3.5毫升聚碳酸酯超速离心管（Beckman Coulter，目录号：349622）
7. 摆臂转子（Beckman Coulter，型号：TLS-55，目录号：346134）
8. 2.2ml Ultra-Clear TM离心管（Beckman Coulter，目录号：347356）
胰蛋白酶处理完整的叶绿体
1. 移液器（Gilson，型号：P20，P200，P1000和P5000，目录号：F123600，F123601，F123602和F123603）
碱性提取叶绿体
1. 移液器（Gilson，型号：P20，P200，P1000和P5000，目录号：F123600，F123601，F123602和F123603）
2. 角转子（Beckman Coulter，型号：TLA-100.3，目录号：349490）
3. Optima TM TL超速离心机（Beckman Coulter）
4. 1.5ml Polyallomer管（Beckman Coulter，产品目录号：357448,355919）
用于评估蛋白质浓度的斑点印迹分析
1. 移液器（Gilson，型号：P20，P200，P1000和P5000，目录号：F123600，F123601，F123602和F123603）
2. Labo振动筛（BIO CRAFT，型号：BC-740）

程序

载体的构建和拟南芥转化
为了向叶绿体IEM递送感兴趣的蛋白质，我们必须将至少两个不同的靶向信号融合到其中。一个信号是转运肽，另一个是叶绿体IEM靶向信号（图3）。已知转运肽作为靶向叶绿体基质的靶向信号，并发现靶向叶绿体内部的大多数前体蛋白质中。然而，转运肽似乎不足以将货物蛋白质，在我们的情况下是蓝藻碳酸氢盐转运蛋白，导向叶绿体IEM。作为额外的IEM靶向信号，我们将Cor413im1蛋白质的成熟部分与图3所示的嵌合构建体融合。这部分可以在转基因植物拟南芥中（上原等，，2016）。另一项研究显示膜蛋白质前导序列可以在瞬时表达系统中充当IEM靶向信号（Rolland等人，2016）。此外，如果没有特异性抗体，则需要添加标签来检测嵌合蛋白。
已经在别处详细描述了图3所示的转运肽的长度和Cor413im1的成熟部分（Okawa等人，2008和2014）。

图3.针对碳酸氢根转运蛋白SbtA II特异性靶向叶绿体IEM的构建设计本研究中使用的嵌合SbtAII构建体的示意图。 TP表示转运肽，并作为叶绿体的靶向信号。构建体的Cor413im1部分来源于Cor413im1的成熟部分，可以作为叶绿体IEM的靶向信号。融合构建体的蛋白A结构域含有来自葡萄球菌蛋白A的两个IgG-结合结构域，并用作检测嵌合蛋白的标签。
拟南芥叶绿体分离
基于Smith等人（2002）中描述的方法，我们开发了使用更少数量的植物分离足量的完整叶绿体的方法。如果不能获得大量的种子来分离叶绿体（例如，突变体，转基因品系），则该方法是有用的。在整个过程中，除非另有说明，样品应保存在冰上，并且在实验之前应将缓冲液冷冻。
1. 在0.5x MS平板上播种灭菌的种子（每个平板100个种子，每个隔离四个平板，参见食谱），补充有1％蔗糖。在16小时/ 8小时黑暗循环下，允许拟南芥属植物在生长室中生长，100μE/ m 2•s -1，，22℃14-18天（图4A）。
2. 用刀片收获植物的整个地上部分，并立即放在含有10ml消化缓冲液（参见食谱）的直径为90mm的培养皿上。将从两个平板收获的植物放入一个酶消化反应中，以便您需要为四个拟南芥菜板制备两个直径为90mm的培养皿。当所有的组织都被收获后，使用剃刀片快速切碎组织1分钟（图4B）。
  注意：切勿超过1分钟或粉碎组织。
3. 从培养皿中取出消化缓冲液。加入13.5毫升消化酶溶液（见食谱）到培养皿中，用指尖均匀分布组织（图4C）。将培养皿置于塑料容器中，并在22℃下在生长室中孵育3小时（光强度约为50-100μEm-2 s -1 ^）。
4. 在消化过程中，在50ml离心管中准备40％（20ml，上层）：85％（7ml，下层）AT Percoll（见食谱）梯级，并保持在冰上。我们对两个拟南芥板使用一个梯度（一个酶消化），所以我们通常为一个分离准备两个梯度。你也可以使用较小的Percoll体积和管（Smith等人，2002年）。
5. 通过平板轻轻旋转（或温和搅动）30-60秒，收获原生质体，然后通过200微米的锥形滤网，放入一个小漏斗，在冰上的50毫升离心管过滤介质。从一个培养皿收集原生质体到一个50毫升管，你需要准备两个管。将尼龙网中的任何组织转移回培养皿中，并用10ml冰冷的新鲜消化缓冲液洗涤组织。将组织缓冲液混合物过滤到相同的50ml离心管中。将组织再清洗一次或两次，以确保尽可能多的原生质体释放（图4D）。
6. 在100℃，4℃下将原生质体离心5分钟（图4E）。用吸气器小心取出并丢弃上清液。小心不要打扰原生质球，因为它很松散。
7. 在5毫升原生质体重悬缓冲液（见食谱）中重悬沉淀，轻轻地旋转沉淀，同时将缓冲液分配到管的侧面。原生质体重新悬浮后，再加入5毫升原生质体重悬缓冲液，轻轻混合（图4F）。在100℃，4℃下将原生质体离心4分钟（图4G）。
8. 去除上清液，并悬浮在5毫升原生质体破碎缓冲液颗粒（见食谱）。原生质体重新悬浮后，再添加5毫升原生质体破碎缓冲液，轻轻混合（图4H）。立即将重新悬浮的原生质体沉淀转移到原生质体破裂装置的桶中。将装置的末端保持在冰上的50ml离心管上，小心地更换柱塞，轻轻地将悬浮液通过网格层（图4I）。重复此过程一次。
9. 快速小心地将10毫升破碎的原生质体铺在AT Percoll台阶梯度上（图4J）。在2,500×g，4℃下，在摆动转子中离心10分钟，关闭制动器（图4K）。离心后，梯度上应该有两条可见的绿色条带：在原生质体破碎缓冲液/ 40％Percoll界面的破碎的叶绿体上带，以及在40％/ 85％Percoll界面下的完整叶绿体的下带。通过抽吸去除负载区和破碎的叶绿体的上层带。使用巴斯德吸管收获较低的带，并用50ml离心管（图4L）中的40-45ml HEPES-山梨糖醇缓冲液（见配方），pH8.0稀释完整的叶绿体。来自两个AT Percoll梯度的完整叶绿体应合并成一个管。
10. 在700℃，4℃离心稀释的完整叶绿体5分钟（图4M）。小心地滗析上清液，丢弃所有过量的缓冲液，不要中断沉淀。重悬沉淀物（200-300μl）HEPES山梨糖醇缓冲液，pH值为8.0（图4N）。
11. 将5μl叶绿体再悬浮液稀释到995μl80％丙酮中。剧烈混合并在约15,000×g下微离心2分钟以除去蛋白质沉淀。用80％的丙酮空白测量上清液的A 652。通过使用以下等式（Smith等人，2002）计算叶绿素浓度（mg / ml）：
  （A <652/36）×200
  以弥补稀释因素。使用HEPES-山梨糖醇缓冲液将叶绿素浓度调节至1mg叶绿素/ ml。制备的叶绿体应立即用于程序C和D，而用于程序E的叶绿体可以在-80℃下保存。
  
  图4.拟南芥叶绿体分离概述（程序B）
叶绿体分馏
1. 将步骤B11中制备的0.5毫升1毫克叶绿素/毫升叶绿体在700℃×4℃下离心5分钟。去除上清液并通过移液测量上清液的体积。在含有0.6M蔗糖的TE / DTT缓冲液（见配方）中将叶绿体沉淀重悬浮至浓度为1mg / ml叶绿素（图5A）。让我们站在冰上10分钟。在-20°C冻结叶绿体悬液1-2 h。如果不立即进入分馏阶段，可以将冷冻的叶绿体悬液保持在-80°C直到使用。
2. 解冻悬浮液，用3倍体积的TE / DTT缓冲液稀释。为了收集叶绿体总蛋白，在加入TE / DTT之前，将5μl叶绿体悬浮液加入到1.5ml微管中。在Dounce（或Potter）匀浆器中用紧杵匀浆20次（图5B）。将悬浮液转移到3.5ml聚碳酸酯超速离心管中。在固定角度的转子中，在40,000×gg，4℃下超速离心裂解的叶绿体1小时（图5C）。
3. 使用移液管移除含有基质成分的褐色上清液并储存在-80℃（图5D）。通过移液（图5D）和匀化（图5E，在Dounce匀浆器中20次冲击），将含有0.2M蔗糖的TE / DTT缓冲液中的膜沉淀重悬浮至浓度为1mg叶绿素/ ml。
4. 在2.2ml多聚体离心管中建立由1ml 1M蔗糖和0.7ml 0.46M蔗糖组成的蔗糖梯度梯度。将膜悬浮液（0.2M蔗糖）铺在顶部（图5F和图6A）。在每个梯度上应用0.5毫升膜悬浮液。使用低加速和减速速率在摇摆转子转子中以270,000×g，4℃超速离心样品1.5小时（图5G）。从梯度的每一步收集界面（图5H和图6B）。上界面（0.2：0.46 M蔗糖）含有残余的基质和plagoglobules。中间界面（0.46：1M蔗糖）高度富集信封膜。类囊体膜在管的底部形成紧密的小球。
5. 通过加入100％三氯乙酸（TCA）使终浓度为10％和tRNA达到10μg/ ml的终浓度来沉淀基质蛋白质（在步骤C2中收集）。在冰上孵育60分钟或更长时间。通过在〜20,000×g，4℃下离心30分钟收集TCA沉淀物。用1ml的80％丙酮洗涤沉淀并在〜20,000×g，4℃下离心15分钟。直接在200μlSDS样品缓冲液中重悬沉淀（见食谱）。
6. 沉淀总叶绿体蛋白质（步骤C2中收集5μl），加入1ml 80％丙酮并涡旋。将管保持在冰上30分钟，并在〜20,000×g，4℃下离心30分钟。直接在50μlSDS样品缓冲液中重悬沉淀。
7. 为了收集包膜，用3至5体积的TE / DTT缓冲液稀释0.46:1M蔗糖界面部分，并在270,000 emg，4℃图5J）。用移液管取出上清液并丢弃。将沉淀重悬于30μlSDS-样品缓冲液中进行分析（图5K）。
8. 将类囊体团粒悬浮在0.3ml SDS-样品缓冲液中（图5H）。
9. 在每个部分中的蛋白质定量后，通过SDS-PAGE分析总叶绿体（3μg），基质（3μg），包膜（1μg）和类囊体（1.5μg）部分。
  
  图6.用于分离包膜和类囊体膜的蔗糖密度梯度超速离心的示意图（步骤C4）。该实验使用2.2ml Ultra-Clear TM离心管。 A和B分别表示超速离心前后的蔗糖密度梯度。
胰蛋白酶处理完整的叶绿体
胰蛋白酶能渗透完整的叶绿体的外膜膜（OEM）而不是内膜膜（IEM）（Jackson等人，1998; Inaba等人的，2003）。因此，定位于OEM的蛋白质如Toc75对胰蛋白酶处理敏感。这种方法使我们能够确定一个感兴趣的蛋白质是否定位于叶绿体的OEM或IEM。
1. 用125μlHEPES-山梨糖醇缓冲液稀释25μl1mg叶绿素/ ml完整叶绿体（步骤B11）。
2. 加150μL2x胰蛋白酶缓冲液（见食谱），轻轻混合，并在冰上孵育30-40分钟。
3. 停止反应加入300μL的2个停止缓冲液（见食谱）。颠倒管子数次，小心混合，在冰上孵育10分钟。在冰上孵育后，通过1×40％Percoll（参见配方）在2,500×g，4℃下离心5分钟来分离叶绿体。
4. 小心吸出上清液和1×40％Percoll，含有一些破碎的叶绿体。
5. 在500μl的1x HEPES-山梨糖醇缓冲液中重悬叶绿体沉淀（参见食谱）。在2,500×g，4℃下离心叶绿体2分钟。去除上清液，并悬浮在50μL的SDS - c omplete TM缓冲液（见食谱）颗粒。
碱性抽提叶绿体
为了研究感兴趣的蛋白质是否整合到包膜中，可以对叶绿体进行碱提取。如果蛋白质被整合到包膜中，则应在碱提取和随后的超速离心后将其回收在沉淀部分中。在外周相关的IEM蛋白如Tic22在提取过程中从IEM释放（Kouranov等，1998）。
1. 在1.5ml多聚体共聚物试管中，将25μl1mg叶绿素/ ml叶绿体（步骤B11）稀释到1ml 0.2M Na 2 CO 3，pH 12中，在冰上10分钟。
2. 在一个固定角度的转子中以100000×g，4℃超速离心该混合物15分钟。小心地收集含有基质的上清液并转移到新鲜的试管中。用80μlSDS-样品缓冲液重悬膜沉淀。彻底溶解颗粒。
3. 通过添加100％（w / v）TCA至终浓度10％（w / v）和tRNA至终浓度10μg/ ml来沉淀碱性上清液。在冰上孵育30至60分钟。
4. 通过在〜20,000×g，4℃下离心30分钟收集TCA沉淀物。用1ml的80％丙酮洗涤沉淀并在〜20,000×g，4℃下离心15分钟。
5. 直接重悬沉淀80μLSDS样品缓冲液。
  完全溶解颗粒
用于评估蛋白质浓度的斑点印迹分析程序C和D的样品浓度估计如下进行：
1. 用Whatman 3M 3MM色谱纸（3MM纸）裁下一个正方形，并放在一张干净的纸巾上。
2. 标记BSA标准的浓度，并用铅笔在3MM纸上测试每个样本（见图7）。
3. 用SDS-样品缓冲液稀释2.0mg / ml牛血清白蛋白（BSA），制成BSA标准品（0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2和1.5mg / ml）。用3μlSDS-样品缓冲液稀释3μl待测样品。如果蛋白质浓度预计很高，请按图7所示进行连续稀释。
4. 轻轻地点2微升BSA标准和每个样品到移液器的3MM纸上。
5. 将3MM纸在室温下干燥至少20分钟。
6. 在考马斯蓝染色的摇床上染色30分钟。
7. 尽可能收集考马斯蓝染色剂（可重复使用）。
8. 用考马斯亮点解决方案在振荡器上脱纸。每20分钟更换一次destain解决方案。直到背景清晰。
9. 在纸巾上擦干3MM纸
10. 通过比较印迹颜色的强度和BSA标准来估计每个样本的浓度

数据分析

蛋白质浓度的测定和SDS-PAGE

比较每种信号与BSA标准品的强度并确定蛋白质的浓度（图7：例如），1/2稀释的Cp斑点的信号强度几乎等于0.6mg / ml BSA标准点）。
根据每个级分中蛋白质的量化准备样品。样品体积可以使用SDS-样品缓冲液进行调整。
注意：在大多数情况下，每个部分的一部分足以检测感兴趣的蛋白质。 Cp：Str：Env：Thy（程序C中制备）的蛋白质比率应始终为3：3：1：1.5。

图7.蛋白质浓度的斑点印迹定量。上部分表示BSA标准品（STD）的染色。将分离的叶绿体（Cp）在程序C中分离成基质（Str），包膜（Env）和类囊体膜（Thy）级分。每个样品用SDS-样品缓冲液稀释2,4,8,16,32次。
通过SDS-PAGE分离每个级分中回收的蛋白质（程序C，D和E），并通过Western印迹分析。
研究嵌合蛋白在叶绿体内的定位。作为一个例子，我们使用了SbtAII。使用诸如LSU（基质），Tic110（包膜）和LHCP（类囊体膜）的标记蛋白来确认每个级分的纯度。 SbtAII融合蛋白定位于叶绿体中（图8，泳道Cp）。此外，发现SbtAII融合蛋白高度富集包膜部分（图8，泳道Env）。

图8.嵌合蛋白SbtAII在拟南芥叶绿体中的定位（程序C）。分离出的叶绿体（Cp）分为基质（Str），包膜（Env）和类囊体膜（Thy）。在这些分析中使用的Cp：Str：Env：Thy的蛋白质比率始终是3：3：1：1.5。
用抗蛋白A，LSU，Tic110和LHCP的抗体进行免疫印迹
研究SbtAII是否是外膜或内膜膜蛋白。胰蛋白酶渗透完整的叶绿体的外膜膜，而不是内膜膜。正如所料，OEM蛋白Toc75被胰蛋白酶消化（图9，Toc75）。相反，嵌合SbtAII（图9，蛋白A）和IEM蛋白Tic110（图9，Tic110）对胰蛋白酶具有抗性，表明嵌合蛋白定位于叶绿体的IEM。

图9.嵌合SbtA蛋白在叶绿体中的胰蛋白酶敏感性（程序D）包括外膜蛋白Toc75的蛋白酶敏感性作为阳性对照。内包膜蛋白Tic110的蛋白酶抗性也被列为对照。
研究SbtAII是否被整合到IEM中，或者是与IEM外围相关联的。 Tic110是一个完整的IEM蛋白质，并显示为阳性对照。 SbtAII对碱性提取具有抗性（图10），表明SbtAII是叶绿体IEM中完整的膜蛋白。

图10.嵌合SbtA II蛋白在叶绿体的可溶性和膜级分中的定位（程序E）。用碱性溶液处理的叶绿体分离成不溶性（P）和可溶性（S）级分。包括不溶性蛋白Tic110和可溶性蛋白LSU作为对照。

食谱

0.5倍Murashige和Skoog培养基（MS培养基）（每片60ml）
0.23克Murashige和Skoog植物盐混合物（最后0.5倍）
1克蔗糖（最终1％（w / v）） 0.05克MES（最终2.3mM）
ddH 2 O至100ml，使用1N KOH调节pH至5.7-5.8 调整后，加入0.5克琼脂（最后0.5％）和高压灭菌器
消化缓冲液（4°C储存2周）
1.56克MES（最终20毫摩尔）
29.13克山梨醇（最终400毫摩尔）
200μl1M CaCl 2（最终0.5mM）
ddH 2 O至400ml，使用1N KOH调节pH至5.2
消化酶缓冲液

溶解30克消化缓冲液中的0.6克纤维素酶和0.12克macerozyme 在2,000×g离心10分钟以沉淀不溶性物质
立即使用上清液
40％（v / v）AT Percoll（-20°C储存1个月，使用前立即解冻）
40毫升Percoll（最后40％（V / V））
50毫升梯度缓冲液（最后50％（V / V））
10毫升ddH 2 O
85％（v / v）AT Percoll（-20°C储存1个月，使用前立即解冻）
42.5毫升Percoll（最终85％（V / V））
2.5ml 1M HEPES-KOH，pH7.5（最终50mM）
3.01克山梨醇（最终330毫米）
加入ddH 2 O至50毫升
梯度缓冲液（在4°C下保存2周）
10ml 1M HEPES-KOH，pH 7.5（最终100mM）
12.04克山梨醇（最终660毫摩尔）
200μl1M MgCl 2（最终2mM）
200μl1M MnCl 2（最终2mM）
800μl0.5M EDTA（最终4mM）
0.2克BSA（最后0.2％（w / v））（使用前立即添加）
ddH 2 O至100毫升
原生质体再悬浮缓冲液（4°C下保存2周）
0.39克MES（最终20毫米）
7.29克山梨醇（最终400毫摩尔）
50μl1M CaCl 2（最终0.5mM）
ddH2O至100ml，使用1N KOH调节pH至6.0
原生质体破碎缓冲液（4°C下保存2周）
0.36克Tricine（最终20 mM）
5.47克山梨醇（最终300毫摩尔）
1ml 0.5M EDTA（最终5mM）
0.19 g EGTA（最终5 mM）
0.084g NaHCO 3（最终10mM）
0.1克BSA（最终0.1％（w / v））（在使用前立即添加）
ddH2O至100ml，使用1N KOH调节pH至8.4
HEPES-山梨糖醇缓冲液，pH8.0（在4℃下储存2周）
15ml 1M HEPES-KOH，pH8.0（最终50mM）
18.06克山梨糖醇（最终330毫摩尔）
ddH 2 O至300毫升
含有1,0.6,0.46,0.2和0M蔗糖的TE / DTT缓冲液（在4℃下储存2周）
0.25 ml 1 M Tricine-KOH，pH 7.5（最终50 mM）
20μl0.5M EDTA（最终2mM）
5μl1 M DTT（最终1 mM）（使用前立即添加）
1.712,1.046,0.787,0.343g蔗糖（最终的1,0.6,0.46,0.2和0μM）
ddH2O至5ml
SDS-样品缓冲液（-20℃保存待用）
0.35毫升1M Tris碱（最终350毫摩尔）
0.25ml 20％（w / v）SDS（最后5％（w / v）） 80μl1 M DTT（最终80 mM）
0.15ml 50％（v / v）甘油（最终7.5％（v / v）） 40μl饱和溴酚蓝（最后1％（v / v））
0.13ml ddH 2 O
2x胰蛋白酶缓冲液
8μl1M MgCl 2（最终8mM）
0.2μl1M CaCl 2（最终0.2mM）
HEPES山梨糖醇缓冲液1毫升

在300μl2x胰蛋白酶缓冲液中加入6.6μl20mg / ml胰蛋白酶
2个停止缓冲区
添加2微升50毫克/毫升TLCK
2μl2 mg / ml抑肽酶
10μl200 mM PMSF
20μl10 mg / ml胰蛋白酶抑制剂
20μl0.5M EDTA
在1ml HEPES-山梨糖醇缓冲液中
1倍40％Percoll
加入1微升50毫克/毫升TLCK
1μl2 mg / ml抑肽酶
5μl200mM PMSF
10μl10 mg / ml胰蛋白酶抑制剂
10μl0.5M EDTA
在1毫升40％Percoll
1倍HEPES山梨醇缓冲液
加入1微升50毫克/毫升TLCK
1μl2 mg / ml抑肽酶
5μl200mM PMSF
10μl10 mg / ml胰蛋白酶抑制剂
10μl0.5M EDTA
在1ml HEPES-山梨糖醇缓冲液中
SDS-cOmplete 缓冲区
10μl0.5M EDTA（最终10mM）
20μl25x cOmplete TM EDTA不含EDTA（最终1x）
470μlSDS-样品缓冲液
考马斯蓝染色（在室温下储存）
0.125克考马斯蓝R250（终浓度0.125％（w / v））
50ml甲醇（最终50％（v / v））） 10ml乙酸（最终10％（v / v））） ddH 2 O至100毫升
考马斯亮丽溶液（室温储存）
45毫升甲醇（最后45％（v / v）） 10ml乙酸（最终10％（v / v））） 45毫升ddH 2 O

致谢

这个协议是从以前发表的作品（上原等人，2016年）修改的。这项工作得到了JSPS KAKENHI基金号码17J06506（至S.U.），17K07762（至Y.I.I）和15K07843（至T.I.）的支持。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

Inaba，T.，Li，M.，Alvarez-Huerta，M.，Kessler，F.and Schnell，D.J。（2003）。 atTic110可以作为协调蛋白进入叶绿体的基质事件的支架。 J Biol Chem 278（40）：38617-38627。
Jackson，D. T.，Froehlich，J.E。和Keegstra，K。（1998）。叶绿体蛋白质易位装置的内包膜组分Tic110的亲水区面向基质隔离室。 J Biol Chem 273（26）：16583-16588。
Kouranov，A.，Chen，X.，Fuks，B。和Schnell，D.J。（1998）。 Tic20和Tic22是叶绿体内膜蛋白进口仪器的新成分。
Okawa，K.，Inoue，H.，Adachi，F.，Nakayama，K.，Ito-Inaba，Y.，Schnell，D.J.，Uehara，S。和Inaba，T.（2014）。体内定位多叶膜蛋白至叶绿体内膜包括多个跨膜片段。 / a> J Exp Bot 65（18）：5257-5265。
Okawa，K.，Nakayama，K.，Kakizaki，T.，Yamashita，T。和Inaba，T。（2008）。将cor413im蛋白鉴定为叶绿体内包膜的新组分。 Plant Cell Environ 31（10）：1470-1483。
Rolland，V.，Badger，M.R。和Price，G.D。（2016）。将蓝细菌碳酸氢盐转运蛋白BicA和SbtA重定向到叶绿体包膜：可溶性和膜状货物需要不同的叶绿体靶向在植物中的信号。植物科学前线7：185.
Smith，M.D。，Schnell，D.J.，Fitzpatrick，L。和Keegstra，K。（2003）。叶绿体蛋白进口的体外分析 > Curr Protoc Cell Biol Chapter 11：Unit11 16.
Uehara，S.，Adachi，F.，Ito-Inaba，Y.和Inaba，T。（2016）。蓝细菌碳酸氢盐转运蛋白在拟南芥叶绿体内膜包膜上的特异性和高效靶向性/ 。 Front Plant Sci 7：16.