材料和试剂

epT.I.P.S 枪头（Eppendorf，目录号：0030000730）
Strata SCX 500 mg / 6 ml试管（Phenomenex，目录号：8B-S010-HCH）
闪烁小瓶4毫升（卡尔罗斯，目录号：HEE8.1）
1.5 ml微量离心管（SARSTEDT，目录号：72.706.700）
2 ml微量离心管（SARSTEDT，目录号：72.695.500）
手术刀（卡尔罗斯，目录号：AH88.1）
微量毛细管移液器，体积1-5微升（西格玛奥德里奇，目录号：Z611239）
硅胶G-25 TLC板20×20厘米（Merck，目录号：1003900001）
Verex Vial Kit 9 mm，μViali3（Phenomenex，目录号：AR0-9974-12）
汉密尔顿注射器25微升（汉密尔顿，目录号：80400）
新鲜的紫草离开开花植物（大小约3.5厘米长）
液氮
[1,4- 14 C]腐胺（3.95GBq / mmol，Amersham Int。，目录号：CFA.301，自Amersham Int。，[1,4- C]腐胺在PerkinElmer仍然可用，目录号：NEC150000MC）
[12C]腐胺（Carl Roth，目录号：4141.2）
闪烁鸡尾酒，Rotiszint eco plus（Carl Roth，目录号：0016.3）
乙腈（Carl Roth，目录号：7330.1）
甲醇（Carl Roth，目录号：P717.1）
氨溶液30％（卡尔罗斯，目录号：CP17.1）
硫酸溶液体积，0.05M（VWR，目录号：319589-500ML）
锌粉（卡尔罗斯，目录号：9524.2）
氢氧化钠（NaOH）（Carl Roth，目录号：6771.1）
磷酸二氢钾（KH 2 HPO 4）（Carl Roth，目录号：T875.1）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Carl Roth，目录号：P018.1）
[14S] Retronecine
注：它是根据Lindigkeit等人，1997年和Hartmann等人，2001年编写的。
乙酸乙酯（Carl Roth，目录号：6784.1）
2-丙醇（Carl Roth，目录号：9866.2）
5％的氨在甲醇（见食谱）
100 mM磷酸盐缓冲液，pH 7.5（见食谱）
流动相TLC（见食谱）

设备

移液器（Eppendorf，型号：Research plus，产品目录号：3123000063）
微型
通风橱（Thermo Fisher Scientific，目录号：1363）
SPE（Agilent Technologies，目录号：5982-9110）的真空管道
灯（卡尔罗斯，目录号：2986.1）
灰浆和杵（卡尔罗斯，目录号：NT80.1）
涡旋振荡器（IKA，型号：Vortex 2）
微型搅拌棒（Carl Roth，目录号：0955.1）
磁力搅拌器（IKA，型号：实验室盘[白色]）
Optima 1 MS GC柱（MACHEREY-NAGEL，目录号：726205.15）
Minispin微量离心机（Eppendorf，目录号：5452000018）
放射性薄层色谱检测器（RITA，Raytest，Straubenhardt）
Tri-Carb 2910 TR LSC低活性液体闪烁分析仪（PerkinElmer）
连接到级分收集器Pharmacia Frac-100（GE Healthcare Life Science）的LiChrograph HPLC（Merck-Hitachi）
EC 250/4 NUCLEOSIL 120-5 C18 HPLC柱（MACHEREY-NAGEL，目录号：720041.40）
为TLC开发室（Carl Roth，目录号：3133.1）
带有SSL注射器的岛津GC-2010气相色谱仪（日本岛津，型号：GC-2010）
岛津AOC-20i自动注射器（岛津，型号：AOC-20i）
Fisons MD 800四极质谱仪

软件

XCalibur 1.1（Thermo Fisher Scientific，德国Dreieich）
GinaStar TLC（Raytest，Straubenhardt）
QuantaSmart TM 4.0（PerkinElmer）

程序

放射性示踪剂喂养实验
1. 将169KBq的[1,4- 14 C]腐胺溶液转移到2ml微量离心管中并蒸发至干燥。
  注意：确保按照放射性工作的官方指导
2. 称取0.04μmol[12C]腐胺在微量级上并转移到另一个2ml微量离心管中。
  注：使用与示踪剂平行的[ 12 C]腐胺的目的是为了让您能够平等地使用经过处理的样品在本实验的后期阶段使用联用技术（如质谱）进行分析。
3. 在步骤A1和步骤A2的每个管中加入1ml自来水。取5μl与3ml闪烁鸡尾酒混合的[14C]腐胺溶液，用Tri-Carb LSC（Tri-Carb Count Conditions for 14℃）定量放射性， C核素为：核素：14C，淬灭设置低能量：14C计数时间（分钟）：5计数模式：正常分析计数周期：1;重复样品计数：1;＃样品瓶/样品：1;计算％参考：关'）。
  注意：
  1. 为了安全起见，请务必根据溶液中腐胺的种类来标记管子（或称为“ 12 C> [/ 14 C]）来避免混淆管子。这个标签应该在每一个连续的步骤中继续。
  2. 任何市售的液体闪烁计数器都可以使用;每次放射性必须被量化时，使用所提到的程序。
  3. 请记住在放射性量化的范围内始终运行一个没有放射性示踪剂的空白来量化背景。
4. 从雏菊植物切下的两朵嫩雏菊叶子未开放的花蕾，立即将一片叶子放入含有[14 C]腐胺溶液的微量离心管中，另一片放入含有[12 C]腐胺溶液的管中（图1）。
  
  图1.示踪剂进料和萃取的工作流程A.步骤A1至A3，示出微量离心管中示踪剂的制备。 B.步骤A4，显示叶子在[12C] - 和[14C] - 示踪剂溶液中的温育。 C.步骤A6至A8用自来水重新填充管子以避免叶子干燥。 D和E.步骤A9至A10显示粉碎叶片并将粉末转移至2ml微量离心管中。 F和G.步骤A11到A12显示叶子的酸性提取。
5. 将灯管中的叶子放置在灯下12小时/ 12小时的明/暗区域中，强度为ca。 1000勒克司。
6. 一旦水被叶子吸收，另外加入1毫升的自来水。避免叶柄变干。
7. 在将自来水加入到含有腐胺的管中后，将5μl的等分试样与3ml的闪烁混合物混合，并使用Tri-Carb LSC定量放射性。 br />
8. 步骤A6和A7重复四天。最后加入1ml自来水至管中后，用该公式计算[14C]腐胺溶液中叶吸收的放射性量：吸收百分数=（169 kBq - [上次测量时出现的千烛烛x 200 +5μl步骤中测量的放射性量]）/ 169kBq×100。
9. 两个叶子分别在液氮中冷冻，并用研钵和研杵粉碎。
  注：砂浆和杵将保留毛孔中的植物碎屑。特别是与用[14E] C]腐胺培养的叶样品一起使用的研钵和研杵必须在使用后小心地处理以净化残留的放射性。
10. 将每个粉碎的叶子转移到2ml微量离心管中（分别标记为[14C] - 叶和[12C] - 叶）。
11. 向离心管中的两个样品中的每一个中加入1.5ml的0.05M H 2 SO 4。
12. 步骤A11的封闭管在室温下涡旋3分钟，并通过离心（10分钟，5000×g）分离细胞碎片。
13. 将步骤A12的上清液分别转移到含有微型搅拌棒的新鲜2ml微量离心管中。
14. 从步骤A13的每个管中取5μl的等分试样，与3ml闪烁鸡尾酒混合，并通过Tri-Carb LSC定量硫酸提取物的放射性。
15. 在步骤A13的每个管中，加入锌粉末刮刀尖，并在磁力搅拌器上搅拌3小时。
  注意：锌粉会将样品中存在的生物碱N-氧化物还原为三级生物碱，并可能导致管内泡沫的形成。避免溢出您的样本。
16. 将步骤A15的每个离心管离心（10分钟，5000×g），并将澄清的上清液施加到位于真空歧管上的Strata SCX-SPE柱上。使用前用6ml甲醇调节药筒并用6ml 0.05M H 2 SO 4平衡。
  注意：
  1. 由于锌中最有可能存在残留放射性，因此务必将锌作为固体放射性物质进行处置。
  2. 每次处理后，Strata SCX-SPE药筒通过对药筒施加一分钟的真空而干燥。
17. 将5μl的每种Strata-SCX柱的流通液的等分试样与3ml的闪烁混合物混合，以使用Tri-Carb LSC（图2）定量并入非生物碱代谢物的放射性。 br />
  
  图2.固相萃取设置。显示步骤A17至A21。：左侧：将SPE小柱装配到装有样品的真空歧管上。在右侧：用标签和闪烁瓶对真空腔体进行试管。
18. 步骤A16的加载的Strata SCX-SPE柱首先用12ml去离子水，然后用12ml甲醇在真空装置上洗涤。
19. 将5μl来自每个Strata-SCX柱体的洗涤步骤的流出物的等分试样与3ml闪烁混合物混合，以使用Tri-Carb LSC定量放射性。
20. 使用含有5％（v / v）氨的3ml甲醇（配方1），使用带有位于两个筒的每一个下的玻璃管的真空歧管洗脱步骤A18的洗过的柱。每个药筒的三个洗脱部分被合并。
21. 将5μl组合洗脱级分的等分试样与3ml闪烁混合物混合，以定量使用Tri-Carb LSC掺入到生物碱化合物中的放射性。
  注意：墨盒很可能会保留一些放射性分子（非常强碱），请确保正确处置。
22. 步骤A20的两管中的组合洗脱组分的溶剂被蒸发
23. 将[14 C]标记的样品（步骤A22）的干燥残余物溶于2ml甲醇中，并通过在两个2ml微量离心管中分别转移1ml而分成相等的部分。（＃23a）和（＃23b）。
24. 两个样品（管＃23a和＃23b）的甲醇被蒸发。
25. 将样品＃23a的干燥残余物溶于50μl甲醇中并储存在-20℃（用于步骤A31）。
26. 样品＃23b的干燥残余物溶于2ml 2N NaOH中。将管关闭并在60℃的加热块中加热3小时。之后，将管打开，溶剂在通风橱中蒸发2天（见注1和注2）。
27. （步骤A22）的[12C]标记样品的干燥残余物溶于2ml 2N NaOH中。将管关闭并在60℃的加热块中温育3小时。之后，将管打开，并在通风橱中将溶剂蒸发2天（见注1和注2）。
28. 用[14 C]标记的步骤A26的水解样品的干燥残余物和用[12 C]标记的步骤A27溶于50μl甲醇中，每个，并储存在-20°C（在步骤A34和B1中使用）。
  
  图3.示踪剂监测示例根据Kruse （2017）的数据。
29. HPLC柱用85％溶剂A（100mM磷酸盐缓冲液，pH7.5，配方2）和15％溶剂B（乙腈）以1ml / min平衡1.5小时。
30. 馏分收集器Frac-100装有4ml闪烁瓶。
31. 将来自步骤A25的20μl样品用Hamilton注射器转移到LiChrograph HPLC的Rheodyne注射器环中，并将阀切换到注射位置。分数收集器被编程为500微升的分数大小。
32. HPLC运行结束后（25分钟），将3ml闪烁鸡尾酒加入收集在闪烁小瓶中的每个馏分中。小瓶关闭，放射性用Tri-Carb LSC定量（图4）。
33. 如步骤A29所述，HPLC柱在运行1.5小时后重新平衡。
34. 用来自步骤A28的[14 C] - 标记的样品重复步骤A30至A33。
35. 步骤A30至A33用[14C] retronecine标准重复
36. 将等份的10μl来自步骤A28的剩余的[14 C] - 标记的样品在1.5ml微量离心管中与10μl[14 C] retrotine标准。
37. 使用步骤A36的样本重复步骤A30至A33。
  
  图4.绘制的放射性色谱图的实例A.步骤A32的未水解的纯化提取物。 B.步骤A34的水解纯化提取物。 C.步骤A35的[14 C] retronecine标准品。 D.步骤A37的标准和水解提取物的混合物。数据根据Kruse 等（2017）。
产品分析
1. 将来自步骤A28的20μl剩余的[14 C] - 标记的样品以5μl的等分试样通过使用微毛细管移液管施加到TLC板上。确保溶剂完全蒸发后再施加下一个等份。这条车道标有[14C]。
2. 以与步骤B1中所述相同的方式，将来自步骤A28的完整的[12 C] - 标记的样品应用于平行于步骤B1的泳道。该车道标有[<12> C]。
3. TLC在20ml流动相（乙酸乙酯：异丙醇：氢氧化铵[30％，v / v]：45:35:20，配方3）的预饱和TLC显影室中显影。
4. 薄层板在通风橱中干燥过夜。
5. 使用带有GinaStar TLC软件的RITA系统检测TLC板的放射性。平行于[14C] - 平面的放射性斑点的[12C] - 平面的面积被刮除，包括上面1cm和1cm用刮勺将其置于2ml微量离心管中（图5）。
  
  图5.产品分析的工作流程A.步骤B1到B4 41显示了开发的TLC。 B.步骤B5显示用RITA系统检测放射性后标记的斑点。 C.步骤B5显示平行于放射性点的[12C] -TLC泳道上的斑点被刮掉。 D.步骤B5到B6显示从TLC板上刮下的硅胶粉末并转移到2ml微量离心管中。
6. 步骤B5的硅胶粉末通过向微量离心管中加入1ml的流动相而悬浮。将样品剧烈摇动并离心（1分钟，5000×g）。将上清液转移到新鲜的2ml微量离心管中并在通风橱中蒸发。
7. 步骤B6重复三次，将上清液转移到同一个2ml微量离心管中以确保完全提取。
8. 将步骤B7产生的干燥残余物溶解在25μl甲醇中，并转移到μVial进行GC-MS分析。用AOC-20i自动注射器注射1μl，在70eV记录电子碰撞质谱。气相色谱条件如下：注射器：250℃;喷射模式不分流;不分流时间1分钟，温度程序：60℃3分钟和60℃至300℃16℃min -1 -1;载气，氦气以1ml min -1（图6）。
  注意：任何市售的GC-MS系统都可以用于此目的，不建议直接注入放射性的区域，这是由于污染昂贵的设备的风险以及不可用的 14 C标记的参考光谱。
  
  图6. GC-MS运行的示例：一种。显示在步骤B8中测量的样品的总离子色谱图（TIC）。 B.显示来自紫草的水解的吡咯烷生物碱的分子量的提取离子色谱图。 C.显示保留指数为1478的质谱，TIC和EIC的最大峰，通过与文献和NIST数据库的比较确定为逆转录酶。数据根据Kruse 等（2017）。

数据分析

通过在步骤A1至A8中用Tri-Carb LSC测量样品等分试样的放射性而得到的数据允许计算作为示踪剂的[14C]腐胺的总摄取量，每分钟衰减（dpm）。
放射性计算使用以下公式：
总放射性[dpm] =（放射性测量值）[dpm] x（总体积）[μl] / 5
由步骤A14至A21中得到的等分试样得到的放射性值可以得出关于掺入放射性的代谢物的化学性质的结论：硫酸提取物中放射性的量表示掺入水溶性和酸性可提取分子中的放射性的量。由于它们是用氨甲醇从SPE中洗脱下来的，因此它们很可能是弱碱，例如生物碱（图3）。
步骤A30至B1的HPLC运行不需要HPLC检测器，因为针对各个级分测量的放射性相对于分数时间点绘图并且由此递送直接放射性图谱。这可以通过使用标准的数据处理软件，如Microsoft Excel，Apple Numbers或Libre Calc或在纸上手动完成。如果掺入示踪剂的SPE纯化的分子携带侧链，所述侧链被酯化为源自示踪剂的[14 C] - 标记的核心结构，则所得到的峰提供见解。与标准物的比较已经是可能将腐胺并入生物碱的首要证据。
在吡咯里西啶生物碱的情况下，从TLC斑点提取的化合物的GC-MS总离子色谱图将通过提取代表[M] 的155 m / z离子进行处理， + retroneine核心结构的分子。在单峰的情况下，该峰的EI质谱允许与如NIST的光谱库或先前公开的吡咯里西啶生物碱的数据进行比较。

笔记

确保正确关闭管子。为了安全起见，建议在管盖上加一些重量，以免被热量打开。
这个过程可能需要很长的时间，这取决于通风橱的层流空气流动，并且可以通过将水与甲醇以1：1的比率混合，或者通过使用氮气流或离心蒸发器来加速。

食谱

5％氨的甲醇溶液
在容量瓶中，将16.67ml 30％氨溶液加入到83.33ml甲醇中
100 mM磷酸盐缓冲液，pH 7.5
将2.449g KH 2 PO 4和14.143g K 2 HPO 4称量到容量瓶中并补足到去离子水1升
流动相TLC
在烧杯中，将45ml乙酸乙酯与35ml 2-丙醇和20ml 30％（v / v）氨溶液混合。流动相必须在使用前新鲜制备

致谢

这项工作由迪特里希•奥伯（Dietrich Ober）给予的DFG资助。我们感谢Dorothee Langel博士的投入和对此方法的贡献。我们感谢Kiel大学的Christoph Gelhaus博士和Maren Hartelt帮助实施这种方法。作者宣称没有利益冲突。

参考

Frölich，C.，Ober，D.和Hartmann，T。（2007）。在三个紫杉科的组织分布，lycopsamine类型的pyrrolizidine生物碱的核心生物合成和多样化。 Phytochemistry 68（7）：1026-1037。
Hartmann，T.，Theuring，C.，Witte，L.和Pasteels，J.M。（2001）。新热带叶甲虫Platyphora boucardi的三级吡咯里西啶生物碱的螯合，代谢和部分合成。昆虫生化分子生物学 31（11）：1041-1056。
Kruse，L.H.，Stegemann，T.，Sievert，C。和Ober，D。（2017）。确定菊花中吡咯里西啶生物碱生物合成的第二个位点以促进花期的植物防御。植物生理学“（Plant Physiol）174（1）：47-55。
Lindigkeit，R.，Biller，A.，Buch，M.，Schiebel，H.M.，Boppre，M。和Hartmann，T。（1997）。吡咯里西啶生物碱的两面：叔胺及其N-氧化物在化学防御中的作用获得性植物生物碱的昆虫 Eur J Biochem 245（3）：626-636。
Niemüller，D.，Reimann，A。和Ober，D。（2012）。参与吡拉西啶生物碱生物合成的高精胺酸合酶在三种双岐杆菌中的不同细胞特异性表达。 / a> Plant Physiol 159（3）：920-929。