材料和试剂

移液器吸头（Corning，Axygen <\ sup>，产品目录号：T-1005-WB-C）
2毫升聚丙烯微量离心管（Corning，Axygen，目录号：MCT-200-C）
无菌注射器（3毫升或更高）
Vivaspin 500浓缩器，MWCO 3 kDa（Sartorius，目录号：VS0191）
鱼
酒精（100％）
（生物技术支持组，目录号：X2555-50）

设备

不锈钢剪刀
移取100-1,000μl（Eppendorf，目录号：3120000267）
超声波水浴（DK SONIC，型号：DK-80）
冷冻离心机（Eppendorf，型号：5415 R）
轨道振动器（Wincom / OEM / Neutral，型号：TS-2000A）

程序

描述胆道清理程序的流程图如图1所示。

图1.描述胆道清理程序的流程图

鱼解剖程序
1. 在每次解剖之前，不锈钢剪刀应该用酒精（100％）清洁以避免污染。
2. 使用不锈钢剪刀从泌尿生殖器毛孔切至鳃。在切开之后，操作者用双手可以将鱼分开，以暴露内脏器官，更具体地是肝脏。
3. 在找到肝脏之后，操作者应该将手指移到该器官的后面，以便定位胆囊，而不会对该器官造成任何机械损伤（图2）。重要的是要注意，有些鱼类或者不拥有胆囊，或者胆囊太小而无法获得足够的胆汁量。
  
  图2.由剪刀尖指出的鱼胆，通常位于肝脏后面。胆囊充满胆汁，胆汁呈浅绿色。
4. 定位胆囊后，使用无菌注射器刺穿胆囊并获得胆汁。尽可能多地去除流体。
5. 应记录胆汁的颜色和体积，立即将样品分装到无菌2毫升聚丙烯微量离心管中，分装成500微升等分试样，如果不立即处理，最好冷冻（最好是在-80℃，如果没有超冷冻器，样品可能在-20°C冷冻）。
胆汁加工
1. 将胆汁样品超声处理5分钟以分解细胞膜。使用冷水浴是优选的。如果没有可用的话，应该每隔20-30秒从浴中移出微量离心管，以避免过热。
2. 超声处理后，将样品在16,000×g（4℃）下离心15分钟以除去细胞碎片。不需要预冷微量离心管，因为在4℃下进行离心分离，下一步在冰上进行。
3. 离心后，将样品上清液转移到新的无菌2ml聚丙烯微量离心管中。可能没有颗粒可见，只有轻微的光滑的薄膜粘在管壁上（步骤B2）。无论如何分离上清液。
4. 然后将样品脱脂以避免在下游蛋白质组学应用中的干扰。
  根据制造商的说明，使用商业固相非离子吸附脂质去除剂Cleanscite。这包括将总共75μl的该试剂加入到300μl的样品中。（这些体积可能会减少，但Cleanscite®解决方案：样品比应保持不变）。在使用前摇动Cleanscite 溶液非常重要，因为清洁剂可能稍微固化。
5. 加入Cleanscite后，将样品在定轨摇床上摇动1小时，然后在16,000×g（4℃）下离心1分钟以沉淀脂质。
6. 离心后，将样品上清液转移到新的无菌聚丙烯微量离心管中。颗粒将，再次，可能仅仅是粘在管壁上的轻微的光滑膜（步骤B5）。无论如何分离上清液。
7. 然后将样品脱盐，因为盐会干扰下游的蛋白质组学应用，并通过使用Vivaspin（或类似的）浓缩器浓缩。使用的分子量截止取决于研究的目的，在这种情况下，3kDa。当使用Vivaspin 500™时，向样品浓缩器中加入500μl样品的最大体积，并在15,000×g的条件下离心30分钟（4℃）。随后，将剩余在浓缩器顶部的液体转移到新的无菌聚丙烯微量离心管中。
8. 样品已准备好用于下游蛋白质组学应用，如酶谱法和质谱法。

数据分析

样品清理程序的适当性可以通过以下方法来验证：

通过Bradford，Lowry或任何其他常规方法确定总蛋白质含量。在样品净化之前，由于存在大量的脂质和胆汁盐，因此获得胆汁中总蛋白质含量的不一致的数据，具有极高的重复变异性。清理后，重复应该是可重复的。
运行1D蛋白质SDS-PAGE电泳或酶谱凝胶以检查涂片（参见Hauser-Davis等人[2012b]，图3，对于在10％明胶酶谱图上显示的不足样品显示出极端的涂片和少量明显的裂解条带，图4和图5为合适的结果）。

笔记

应尽可能新鲜地获得鱼，以避免胆汁样品的蛋白水解降解。
如果需要对食物状况和暴露时间进行推断，则应记录胆汁的体积和颜色（Hauser-Davis，2017）。
避免反复冻融样品（不超过5次），如通常的蛋白质组学应用，以减少不可再现性。

致谢

这个协议是从豪瑟 - 戴维斯等人改编的。（2012B）。没有利益冲突或利益冲突。作者要感谢巴西国家科学和技术发展委员会（CNPq）的财政支持。

参考

Hauser-Davis，R.A。（2017）。在两种环境污染哨点鱼种中鉴定胆汁酪蛋白水解蛋白酶，重点是金属蛋白酶。 / a>在：Daniels，JA（Ed。）。环境研究进展。第55卷：101-126。
Hauser-Davis，R.A.，Goncalves，R.A。，Ziolli，R.L。和de Campos，R.C。（2012a）。鱼胆中金属硫蛋白的新颖报告：SDS-PAGE分析，分光光度法定量和金属形态表征液相色谱耦合到ICP-MS。 Aquat Toxicol 116-117：54-60。
Hauser-Davis，R.A.，Lima，A.A。，Ziolli，R.L。和Campos，R.C。（2012b）。首次报道鱼胆汁中的金属蛋白酶及其作为环境污染的生物指标的潜力 Aquat Toxicol 110-111：99-106。
Pampanin D. M.，Larssen E.，ØysædK. B.，Sundt R.C和Sydnes，M.O.（2014）。研究大西洋鳕鱼胆汁蛋白质组（ Gadus morhua ）：多暴露于多环芳烃的生物标志物。

Mar Environ Res 101：161-168。