材料和试剂

移液枪头：结晶，黄色和蓝色（Gilson，产品编号：JHA004，JHA005和JHA007）
SPL细胞培养皿，90×15mm（SPL Life Sciences，目录号：11090）
猎鹰管15毫升（SPL生命科学，目录号：50115）
PluriStrainer70μm（Pluriselect，目录号：43-50070）
Falcon细胞过滤器40微米（Corning，Falcon ，目录号：352340）
T25培养瓶（SPL Life Sciences，目录号：70125）
T75培养瓶（SPL Life Sciences，目录号：70175）
Diva杯（Diva国际，Lunette，芬兰）
猎鹰管50毫升（SPL生命科学，目录号：50050）
子宫内膜
月经血液
Ficoll-Hypaque（GE Healthcare，Amersham，目录号：17-5442-02）
FITC-结合的抗CD105（Abcam，目录号：ab18278）
别藻蓝素结合的抗CD44抗体（Abcam，目录号：ab81424）
抗CD34抗体[EP373Y]（Abcam，目录号：ab81289）
抗CD133抗体（Abcam，目录号：ab19898）
青霉素/链霉素（Pen / Strep）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
胰蛋白酶B溶液（Sigma-Aldrich，目录号：A2942）
胶原酶I（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：17100017）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：806552）
DMEM-F12（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：11330057）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10270106）
胰蛋白酶-EDTA 0.25％（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25200056）
戊二醛，25％水溶液（Merck，目录号：354400）
乙醇（Merck，目录号：818760）
Fungizone（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15290018）
乙二胺四乙酸四钠盐脱水物（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E6511）
非必需氨基酸（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11140035）
L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25030081）
Hank's平衡盐溶液（HBSS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：24020117）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2058）
用于子宫内膜的隔离介质（见食谱）
电镀媒体（见食谱）
基本媒体的其余部分，除了第一段（请参阅食谱）
隔离媒体经血（见食谱）
胶原酶我（见食谱）

设备

手术刀（精细科学工具，目录号：10011-00，10003-12）
标准无菌镊子（BYDAND，目录号：BSU101）
无菌移液器（SPL LIFE SICENCES，产品目录号：91005）
37℃，5％CO 2细胞培养箱（New Brunswic Scientific，型号：CO-150）。
离心机（Eppendorf，型号：5810 R）
倒置显微镜（奥林巴斯，型号：IX51）
冰箱（Pars，型号：1300）

软件

FlowJo 7.6.1软件（FlowJo，LLC; https://www.flowjo.com ）

程序

注意：子宫内膜活检必须由专家外科医生按照当地的道德操守政策和指引进行。

为了从子宫内膜分离hEnSC，执行以下步骤
1. 子宫内膜标本活检
  活检应取自：
  1. 健康的女性
  2. 年龄：20-35岁之间
  3. 时间：子宫内膜活检和经血分别在月经周期19-24和2-4分离。
  活组织检查不应该从以下方面获得：
  1. 有非子宫内膜良性病理状况，如息肉，增生或癌症的受试者。
  2. 在活组织检查之前的几个月内服用了外源激素如GnRH，黄体酮和其他激素的受试者。
  3. 子宫内膜异位症或任何病理状况的子宫
  4. 在过去3个月内曾使用过设备的受试者。
2. 建议子宫内膜样本大小大于0.5×1×1 cm3。将子宫内膜标本置于预热的（37℃）汉克氏培养基（含有1％Pen / Strep和1μg/ ml的两性胰蛋白酶B）中运输。我们建议活检应在2小时内送到实验室。
  注意：所有步骤均使用预热介质（37°C）。
3. 使用标准的无菌镊子将样本转移到无菌的10厘米培养皿中
4. 加入含有1％Pen / Strep和1μg/ ml amphotrypsin B的新鲜预热Hank's培养基。
5. 从子宫内膜中解剖出子宫肌层，丢弃血液和粘液
6. 用Hank's培养基清洗3次（加入3-4ml培养基，小心地清洗组织并用无菌移液管丢弃培养基）。
7. 将样本转移到另一个无菌培养皿，用无菌镊子。加入隔离介质（避免让样本变干），并用锋利的手术刀切碎。切成1-2毫米的标本。
  注意：
  1. 为避免细胞损伤，请用手术刀垂直切割。
  2. 不要让标本干燥。
8. 将切下的标本转移到带有标准无菌镊子的无菌15ml Falcon管中。加入胶原酶I（1mg / ml）并在37℃（细胞培养箱或水浴）中孵育30-45分钟。
  每5分钟翻转猎鹰管
9. 当细胞与样品分离时（根据样品的大小（1 x 1 x 0.5 cm 3）可能需要2 h），加入预热的（37°C）无菌隔离介质（ 1：2胶原酶I：分离介质）中和胶原酶I.
10. 将其通过70μmFalcon细胞过滤器一次。将其通过40μmFalcon细胞过滤器两次以去除腺上皮组分。离心通过过滤器的细胞在300克xg 10分钟。然而，可以执行或省略离心步骤。
11. 在室温下在15ml Falcon管中的Ficoll缓慢加入通过的细胞（1：1沉淀物：Ficoll [100mg / ml]）（图1）。
  
  图1. Ficoll的hEnSC分离
12. 在400×g离心20分钟。
13. 丢弃含有红细胞的沉淀物，并进入Ficoll的浑浊界面阶段和细胞培养基。
14. 添加4毫升预热的PBS到界面阶段并在100×g下离心10分钟。
15. 弃上清，加入1毫升电镀媒体（见食谱）沉淀物，并转移到T25培养瓶。加入另外2.5ml含有DMEM-F12,15％FBS，1％Pen / Strep的平板培养基。在细胞培养箱中孵育24小时。 T25培养瓶中第一天总体积为3.5ml的细胞培养基可以增加细胞粘附于培养瓶的频率。请注意，较大的体积可能会导致更少的细胞粘附在烧瓶上。
16. 第二天，慢慢加入3毫升以上的平板培养基，并保存在细胞培养箱中1周。不要每天摇晃或打扰。
17. 当细胞达到90％融合时，用预热的PBS洗涤，丢弃PBS，然后加入0.25％胰蛋白酶-EDTA（1ml）。在细胞培养箱中孵育5分钟。细胞从培养瓶中解离后，将细胞转移到15ml Falcon中，加入1ml代替10％FBS，1％Pen / Strep的DMEM-F12。
  在300×g离心10分钟
18. 将细胞沉淀物加入到另外的T25培养瓶（100,000个细胞/ ml）或T75培养瓶（300,000个细胞/ ml）中并且对于其余的细胞传代使用补充有10％FBS，1％Pene / Strep的5和9ml DMEM-F12 （图2）。
19. 3次传代之后，您可以通过扫描电子显微镜（SEM）（图3）扫描细胞。
  
  图2.从子宫内膜分离hEnSC的示意图
  
  图3.来自子宫内膜的子宫内膜干细胞的SEM图像
SEM的细胞准备
1. 细胞用PBS冲洗，然后在2％戊二醛中固定2小时。
2. 用PBS冲洗。
3. 在50％乙醇中孵育10分钟
4. 在70％的乙醇中孵育10分钟。
5. 在80％乙醇中孵育10分钟。
6. 在95％乙醇中孵育10分钟（两次）。
7. 在100％乙醇中孵育10分钟（两次）
8. 将干细胞冷冻3小时。
  注：您可以通过细胞分选仪（MAGS等）将细胞分选为CD146，以确保细胞群被纯化为子宫内膜干细胞。
为了从经血中分离hEnSCs，执行以下步骤（图4）女性月经血（MB）的入选标准是没有阴道分泌物或感染的健康女性，HBV和HCV感染阴性，年龄在20-35岁之间。
1. 用无菌Diva杯收集5毫升的MB，并在20毫升磷酸盐缓冲盐水（50毫升含有2.5微克/毫升fungizone，1％笔/链霉素和0.5毫米EDTA的50毫升猎鹰管1：4（见食谱） PBS）。
2. 缓慢加入1：1血液样品（覆盖）到Ficoll中，并在400×g离心20分钟。
3. 丢弃含有红细胞的沉淀物（颗粒）并取Ficoll和细胞培养基的浑浊界面相（图1）。
4. 将3ml PBS加入界面相，并在100gxg离心10分钟。
5. 将细胞沉淀物悬浮于1ml补充有10％FBS，0.1mM非必需氨基酸和2mM L-谷氨酰胺的DMEM-F12中。
6. 将细胞悬液转移到T25培养瓶中并加入额外的2.5ml电镀培养基。在37℃潮湿的5％CO 2中孵育24小时。
7. 24小时后，慢慢加3 ml电镀液孵育2天后，洗去未贴壁细胞（将细胞培养基从烧瓶中取出并将3ml PBS加入烧瓶中，然后将5ml培养基加入烧瓶中）。用含有DMEM-F12,1％Pen / Strep和10％FBS的培养基代替贴壁细胞群体（图5A）和培养基。
8. 培养基每3-4天更新一次。
9. 当细胞达到90％汇合时，它们使用胰蛋白酶/ EDTA（0.25％）传代（图5B）。
  
  图4.从经血中分离hEnSCs A.样品收集。第二天和第三天月经期间的月经血样本采用歌德杯。这个装置可以被捐献者插入阴道，然后血液被运送到猎鹰。 B. Ficoll分离。
  
  图5. MenSCs的显微图像。：一种。隔离后5天; B.通过1.

数据分析

为了证实子宫内膜干细胞在第三次传代后被分离，可以通过流式细胞术表征细胞表面标志物：CD90（间充质标志物），CD105（内皮糖蛋白），CD44，CD146（子宫内膜干细胞标志物），CD31（内皮标志物），CD34（造血标记）。它们对于这些表面标记物应该是阴性的：CD31，CD34和CD133，而对于这些表面标记物是阳性的：CD90，CD105，CD44和CD146（图1：Ebrahimi-Barough等人， 2：Mobarakeh et al。，2012）。

用PBS洗涤细胞，丢弃PBS，加入0.25％胰蛋白酶-EDTA，离心浮游细胞。
用HBSS + 2％BSA洗涤两次，并以各自供应商推荐的确定浓度与CD90，CD44，CD146，CD34，CD133抗体一起温育。
在室温下黑暗中孵育20分钟
通过流式细胞仪进行分析。如果污迹为绿色，则可以在FL1通道中测量，如果是红色污迹，则可以在FL2通道中测量。此外，垂直列可以选择为直方图。门控策略是基于同种。
使用FlowJo软件分析流式细胞术数据。

笔记

如果用手术刀切割不慎或不垂直切割，细胞可能会被破坏。但是，每天移动烧瓶可能会降低细胞密度并且不能使它们完全粘附。数据分析可以在引用的参考文献中找到。为了从经血中分离hEnSC，如果您没有Diva杯，您必须小心地以无菌方式收集样品。在您收集标本并将其转移到实验室的过程中，可能需要在4°C的冰箱中保存24小时。但是，建议将样品立即转移到实验室以增加细胞存活。

食谱

子宫内膜隔离介质
预热汉克的媒体补充：
5％FBS
1％Pene / Strep
1μg/ ml的两性蛋白B
电镀媒体
预热的DMEM-F12
15％FBS
1％Pen / Strep
1％谷氨酰胺
1μg/ ml的两性蛋白B
基本媒体的其余部分，除了第一次通过
预热的DMEM-F12
10％FBS
1％Pene / Strep
1％谷氨酰胺
经血液隔离介质
2.5微克/毫升fungizone
1％Pen / Strep
0.5 mM EDTA
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
胶原酶I
1毫克胶原酶溶解在1毫升的汉克氏媒体

致谢

我们非常感谢Somayeh Ebrahimi博士和Roya Karimi博士对细胞分离和鉴定的帮助。我们以前的作品改编自提出的协议由“资助号码：92-03-61-21215和92-02-61-22861”资助。 Autours宣称没有利益冲突或利益冲突。

参考

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