材料和试剂

10毫升试管（ASIA KIZAI，产品目录号：2221C010B-10）
50ml管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：339652）
15ml试管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：339650）。
6孔板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：140675）
1.5毫升管（BIO-BIK，目录号：RC-0150）
0.2毫升8管带（Greiner Bio One International，目录号：673210和373270）
96孔板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：167008）
0.22μmPVDF过滤器（Millex-GV0.22μmPVDF 33mm Gamma灭菌）（Merck，目录号：SLGV033RS）
pGEX6P1-GFP-纳米抗体（Addgene，目录号：61838）
大肠杆菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIPL菌株（Agilent Technologies，目录号：230280）
HEK293T细胞（例如，ATCC，目录号：CRL-3216）
荧光蛋白表达载体（例如mEGFP-C1 / N1 [Addgene，目录号：54759和54767]，pmCherry-C1 / N1 [Takara Bio，Clontech，目录号：632524和632523]或pTagRFP-C / N [Evrogen，目录号：FP141和FP142]）
Luria-Bertani（LB）培养基（NACALAI TESQUE，目录号：20068-75）
LB琼脂平板（NACALAI TESQUE，目录号：20069-65）
氨苄青霉素（NACALAI TESQUE，目录号：02739-32）
异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（NACALAI TESQUE，目录号：19742-94）
聚乙二醇单辛基苯基醚（Triton X-100）（NACALAI TESQUE，目录号：12967-45）
谷胱甘肽-Sepharose 4B（GE Healthcare，目录号：17075601）
不含Ca 2+和Mg 2+的磷酸盐缓冲液[PBS（ - ）]（NACALAI TESQUE，目录号：1148215）
CBB Stain One Super（NACALAI TESQUE，目录号：11642-31）
达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM），高葡萄糖（NACALAI TESQUE，目录号：08458-16）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10270106）
Opti-MEM（Thermo Fisher Scientific，目录号：31985070）
二硫苏糖醇（DTT）（NACALAI TESQUE，目录号：14112-52）
聚乙烯亚胺（PEI）Max（Mw40,000）（Polysciences，目录号：24765-2）
HEPES（NACALAI TESQUE，目录号：17546-05）
氯化钠（NaCl）（NACALAI TESQUE，目录号：31320-05）
甘油（NACALAI TESQUE，目录号：17018-25）
通用的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（100x）（NACALAI TESQUE，目录号：04080-11）
注意：这种蛋白酶抑制剂混合物含有4-（2-氨基乙基）苯磺酰氟盐酸盐（AEBSF），抑肽酶，E-64，亮氨酸素硫酸盐一水合物和二氢乙二胺四乙酸二钠二水合物（EDTA）。 >
牛血清白蛋白（BSA）（NACALAI TESQUE，目录号：08587-84）
用于哺乳动物细胞和组织提取物的蛋白酶抑制剂混合物（100x）（NACALAI TESQUE，目录号：25955-11）
注意：该蛋白酶抑制剂混合物含有4-（2-氨基乙基）苯磺酰氟盐酸盐（AEBSF），抑肽酶，E-64，亮氨酸素硫酸盐半水合物，贝他汀和胃蛋白酶抑制剂A.
绑定缓冲区（请参阅食谱）
洗涤缓冲液（见食谱）
2毫克/毫升PEI最大试剂（见食谱）
HEPES，NaCl，Triton X-100和甘油（HNTG）缓冲液（见食谱）

设备

多道移液器（20-200μl）（Greiner Bio One International，目录号：89008200）
吸气器
大型离心机（日立机械，型号：CR22G）
冷却离心机可以设置在4°C（TOMY SEIKO，型号：EX-136）
台式离心机（Eppendorf，型号：5415 R）
用于PCR管的离心机（BM Equipment，型号：ForceMini）
摇摇培养箱（TAITEC，型号：BR-23FP）
旋转器（TAITEC，型号：RT-50）
超声波仪（Misonix，型号：S-4000）
荧光显微镜（Keyence，型号：BZ-8000）
物镜（尼康，PlanApo 20x NA0.75 WD1.00）
500ml烧瓶（AGC Techno Glass，目录号：4551FK500R）
分光光度计（GE healthcare，型号：Ultrospec TM 2100 pro）
比色杯（GE Healthcare，目录号：80-2076-38）

程序

GST-标记的抗GFP纳米抗体的制备
这里我们介绍制备GST标记的抗GFP纳米抗体的方法。在我们的条件下，我们通常从200ml的E纯化约1mg的蛋白质。大肠杆菌培养。
1. 拿起一个E的单个殖民地。携带pGEX6P1-GFP-纳米抗体的大肠杆菌接种3ml含有50μg/ ml氨苄青霉素的LB培养基的发酵剂培养物，在菌落的试管中接种，在37℃下剧烈振荡培养过夜-200转。
2. 用2ml过夜培养物接种含有200ml LB培养基加50μg/ ml氨苄青霉素的烧瓶，并在37℃以130rpm振荡孵育，直到培养物达到OD 600 = 0.5 。（需要2-4小时）
3. 为了诱导GST-标记的抗GFP纳米抗体的表达，将200μl的100mM IPTG（终浓度0.1mM）加入到烧瓶中，并且将烧瓶在30℃下以130rpm振荡孵育4小时。 />
4. 将培养物转移至合适的离心管中，并通过在4℃下以5,550xg（例如6,000rpm，在Himac CR22G离心机中）离心15分钟来收获细胞15分钟。
5. 倒掉上清液，通过涡旋将细胞悬浮在10ml结合缓冲液（参见食谱）中。
6. 将细胞悬浮液转移到50ml管后，通过超声破碎细胞。超声在冰上进行5轮（15秒ON和15秒OFF），使用Astrason S4000，幅度为30％。
7. 加入0.5ml在H 2 O中稀释的20％Triton X-100至终浓度为1％，并在4℃（或在冰上）孵育20分钟以帮助细胞裂解。
8. 在4℃下，将管子在20,700×g（例如，12,000rpm，在Himac CR22G离心机中）离心20分钟，并将上清液转移到15ml管中。
  注意：我们通常将上清液分成2 x 5 ml。此后，我们使用2管。
9. 加入2.5ml（床体积）在PBS（ - ）中平衡的谷胱甘肽 - 琼脂糖4B珠粒至5ml上清液中，并通过在4℃（12-24小时）下旋转管子使纳米抗体与珠子结合，。
10. 在4℃下以780×g（例如2000rpm，在EX-136离心机中）离心试管2分钟，并通过抽吸去除上清液。 >
11. 加入10毫升冰冷清洗缓冲液（见食谱）
12. 重复步骤A10和A11八次。
13. 将珠子保持在洗涤缓冲液中（即，2.5ml珠子和2.5ml洗涤缓冲液）为1：1浆液。珠子可以在4°C下储存数月。
  注意：我们通常将珠浆分成1毫升（床体积500微升）等份。
14. 通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝（CBB）染色检查纯化的GST-标记的抗GFP纳米抗体的质量和数量。在我们的制备条件下，纯化纳米抗体蛋白质的约1μg/5μl（床体积的珠）。一个典型的结果如图1所示。
  
  图1.纯化的GST-标记的抗GFP纳米抗体的典型结果。纯化的GST标记的抗GFP纳米抗体和BSA进行SDS-PAGE，然后进行CBB染色。通过比较纯化的蛋白质与BSA的条带强度，纯化的GST标记的抗GFP纳米抗体的浓度估计为约1μg/5μl（床体积）。
VIP分析
这里我们介绍如何进行VIP测定（图2和视频1）。

图2. VIP测定概述。将GFP融合蛋白和RFP融合蛋白的表达载体共转染到HEK293T细胞中。 24小时后，通过荧光显微镜确认荧光蛋白的表达。接下来，制备转染的细胞的裂解物，并使用GST-标记的抗GFP纳米抗体珠粒进行处理以用于免疫沉淀。最后，在荧光显微镜下观察带有免疫沉淀物的珠子。当两种蛋白质相互作用时，GFP和RFP信号都可以在珠上检测到。另一方面，当两种蛋白质不相互作用时，只能观察到GFP信号。

视频1
1. 将HEK293T细胞（大约8×10 5个细胞）种入6孔板，并在2ml补充有5％FBS的DMEM高葡萄糖中孵育24小时。
2. 使用PEI Max试剂与GFP融合蛋白和RFP融合蛋白的表达载体共转染细胞（见食谱）。
  1. 在1.5ml试管（例如，2μgGFP表达载体和2μgRFP表达载体）中混合250μlOpti-MEM与4μgDNA。
  2. 在另一个1.5 ml试管中混合250μlOpti-MEM和10μl2 mg / ml PEI Max试剂，室温孵育5分钟。
  3. 将DNA溶液与PEI Max溶液混合，涡旋混匀，在室温下孵育20分钟。
  4. 加入500μl的DNA / PEI混合物到6孔板的每个孔中
3. 24小时后，在荧光显微镜下观察细胞，检查GFP融合蛋白和RFP融合蛋白的表达。
4. 通过抽吸将培养基从培养板中完全除去，向每个孔中加入250μl冰冷的HNTG缓冲液（参见食谱），将培养板在冰上孵育5-10分钟以分离贴壁细胞。
5. 通过移液悬浮细胞，将细胞悬液转移至1.5ml管中，并将管在冰上孵育15分钟以裂解细胞。
6. 在4℃，以16,100×g（例如，在1350rpm，在5415R离心机中）离心试管15分钟。
7. 将200μl上清液转移到0.2ml含有GST-标记的抗GFP纳米抗体的预先结合谷胱甘肽 - 琼脂糖珠（约5μl（床体积）的珠）的8-管带上，并将8管带孵育1小时在4°C的恒定旋转使用管旋转器。
8. 离心8管带30秒，并吸取上清液。
9. 加入180微升冰冷的HNTG缓冲液，并通过点击8管带混合内容。
10. 重复步骤B8和B9三次
11. 最后，将珠子悬浮在180μl冰冷的PBS（ - ）中，并将珠子悬浮液转移到96孔板上。
12. 在荧光显微镜下观察珠子上的绿色和红色荧光，并获取图像。为了比较荧光强度，在固定条件下（相机的曝光时间和ISO感光度）获取图像。
13. 收集珠子，如果需要免疫印迹。

数据分析

VIP分析的例子
负责睫状蛋白运输的眶内运输（IFT）-B复合物是由16个亚基组成的巨大蛋白质复合物。我们通过VIP测定不仅确定二元相互作用而且确定IFT-B亚基的一对多和多对多蛋白质相互作用（Katoh等， / em>，2016）。在这里，我们展示了一些IFT-B亚基的相互作用分析的例子。
1. 实验例1：二元蛋白质相互作用
  对GFP标记的和mCherry（mChe）标记的IFT74和IFT81（图3A）进行VIP测定。在左边的第四和第五个面板中的红色信号表明IFT74和IFT81相互作用。
2. 实验例2：一对二的蛋白质相互作用
  VIP测定在GFP标记的IFT22和mChe标记的IFT74，IFT81或IFT74 + IFT81（图3B）上进行。 GFP-IFT22不与单独的mChe-IFT74或mChe-IFT81相互作用。然而，GFP-IFT22与mChe标记的IFT74 + IFT81异二聚体相互作用（图3B中最右侧的面板）。为了证实IFT74和IFT81都与IFT22结合，在VIP测定后进行免疫印迹（图3C）。 VIP测定和免疫印迹的结果显示IFT22仅与IFT74-IFT81异二聚体相互作用（图3D）。
  如上所述，VIP测定法是一种灵活多变的方法，可以全面检查二元蛋白质相互作用并检查更复杂的一对多和多对多蛋白质相互作用。
  最后，我们描述关于VIP测定的笔记。在这种方法中，使用适当的正面和负面控制是非常重要的。作为阳性对照，应该使用已知相互作用的蛋白质。作为阴性对照，仅使用荧光蛋白。使用适当的实验对照便于确定蛋白质 - 蛋白质相互作用是正面的还是负面的。
  
  图3. VIP测定揭示的IFT亚基之间的相互作用。：一种。二元蛋白质相互作用。 VIP测定在GFP-或mChe-标记的IFT74和IFT81上进行。 B.一对二的蛋白质相互作用。对GFP标记的IFT22和mChe标记的IFT74，IFT81或IFT74 + IFT81进行VIP测定。 C.在B中显示的VIP测定后进行免疫印迹。D.IFT22，IFT74和IFT88的相互作用模式。（来自加藤和中山，2017;经YODOSHA Co.，Ltd.许可）

食谱

绑定缓冲区
PBS（ - ）
5 mM DTT
通用的蛋白酶抑制剂混合物（0.5mM AEBSF，0.15μM抑肽酶，1μME-64,1μM亮抑酶肽半硫酸盐一水合物和0.5mM EDTA）。
清洗缓冲液
PBS（ - ）
5 mM DTT
0.1％Triton X-100
2毫克/毫升PEI Max试剂
将20mg PEI Max溶于10ml经过滤灭菌的Milli-Q级水中该溶液分成1毫升等分试样，可以在4°C储存几个月
对于更长期的，它可以被存放在-20°C
HEPES，NaCl，Triton X-100和甘油（HNTG）缓冲液注意：这是一个裂解缓冲区的例子。其他裂解缓冲液也可以用于VIP分析。
20毫米HEPES（pH7.4）
150 mM NaCl
0.1％（w / v）Triton X-100
10％（w / v）甘油
与哺乳动物细胞和组织提取物一起使用的蛋白酶抑制剂混合物（1mM AEBSF，0.8μM抑肽酶，15μME-64,20μM亮肽素半硫酸盐一水合物，50μM苯丁抑菌素和10μM胃酶抑素A）

致谢

该协议改编自加藤等人（2015年），加藤等人并在其中使用。（2016），Katoh和Nakayama（2017）。这项工作得到了日本文部科学省创新领域纤毛和中心体科学研究资助（部分15H01211至Ka.N.）的支持。日本科学促进会资助（授予号码15H04370至Ka.N.，授权号码15K07929至Y.K.）;从武田科学基金会和上原纪念基金会到Y.K.作者宣称没有利益冲突。

参考

Hirano，T.，Katoh，Y。和Nakayama，K.（2017）。 Intraflagellar运输 - 一种复合物介导睫状体进入和睫状G蛋白偶联受体的逆行运输。 Mol Biol Cell 28（3）：429-439。
Katoh，Y.和Nakayama K.（2017）。可见免疫沉淀试验：一种方便和多功能的方法研究蛋白质相互作用使用荧光融合蛋白。实验医学35：85-95（日文）。
Katoh，Y.，Nozaki，S.，Hartanto，D.，Miyano，R.和Nakayama，K.（2015）。通过使用荧光融合蛋白的可见免疫沉淀测定揭示的多亚基复合物的体系结构 J Cell Sci 128（12）：2351-2362。
Katoh，Y.，Terada，M.，Nishijima，Y.，Takei，R.，Nozaki，S.，Hamada，H。和Nakayama，K.（2016）。含有Cluap1 / IFT38的Intraflagellar Transport（IFT）-B复合体的总体结构是IFT-B外周亚复合物 J Biol Chem 291：10962-10975。