材料和试剂

1.7 ml微量离心管，高压灭菌（Corning，Axygen ，目录号：MCT-175-C）
无菌Petrie盘子35 x 10毫米（Corning，Falcon ，产品目录号：351008）
无菌5毫升螺旋顶管（Techno Plas，目录号：P5016SU）
手套
供体SPF雌性NOD小鼠（NOD小鼠来源于澳大利亚墨尔本的Monash动物研究平台）
受孕的无菌雌性NOD小鼠，怀孕（GF NOD小鼠来自Germ Free Unit，Walter和Eliza Hall医学研究所）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：NIST2186II）
磷酸二氢钾（KH2PO4）（Sigma-Aldrich，目录号：NIST200B）
乙醇（Merck，目录号：818760）
10倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
无菌无氧脱氧1x PBS（见食谱）
70％乙醇（见食谱）

设备

P1000移液器（Eppendorf，目录号：3121000120）
手术工具
1. 精美的虹膜剪刀，精致的图案，直径11.5厘米（精密科学工具，目录号：91460-11）
2. 标准模式镊子，12厘米直（精细科学工具，目录号：11000-12）
3. 标准图案镊子，12厘米弯曲（精细科学工具，目录号：11001-12）
4. 弯头20 G 38毫米（ABLE Scientific，目录号：ASGN7910）
层流罩
使用S10N-5G分散元件（IKA，型号：S 10 N - 5 G）组织匀浆器，IKA T10基本型（IKA，型号：T 10 basic）
二类生物安全柜
高压灭菌器
用于15ml锥形管的台式离心机（Eppendorf，型号：5810）
传统的小鼠笼

程序

供体小鼠制备
1. 在同一个笼子中共饲养供体SPF雌性NOD小鼠，或者在开始饮食治疗之前每周3次在笼子中随机交换它们。
2. 在开始用饮食治疗之前重复此程序3周。
3. 饲喂10周龄的供体雌性NOD小鼠与饮食5周并在15周龄时收集粪便和盲肠内容物。饮食的选择是在这个议定书中检查的变量，以查看饮食效果是否通过改变微生物的作用。
4. 从饮食组内的所有供体小鼠收集粪便以更广泛地采样存在的微生物。接受灌胃的每两只老鼠收集一只老鼠的盲肠内容物。由于在实验过程中会发生多个微生物群的收集和捐赠，所以将来自所有供体小鼠的粪便样本汇集在一个治疗组中对于保持一致的微生物群转移是必不可少的。
混合盲肠和粪便样品的制备
1. 粪便收集
  1. 将已经饲喂了5周的个体供体小鼠置于层流罩下的清洁空笼中。
  2. 在小鼠生产后立即收集笼子底部的小球，并置于无菌1.5ml微型管中，室温下含有500μl无菌PBS（见食谱）。
2. 盲肠内容收集
  1. 牺牲捐助老鼠根据道德准则。
  2. 解剖前，将小鼠浸入70％乙醇中（见食谱）。解剖鼠标并收集层流罩内的盲肠内容物，以避免外部污染。为此，通过腹部的皮肤和腹膜进行纵向切口以暴露腹腔。
  3. 从盲肠切除小肠和结肠，将盲肠切除（见图1），并置于无菌培养皿中。＆nbsp;
    
    图1.去除小鼠盲肠：一种。切除盲肠与小肠和大肠之间的连接处。 B.贝因以后的盲肠
  4. 切除盲肠末端，并在室温下将内容物排入含有1ml PBS的无菌5ml管中。这最好通过使用一对扁平镊子将盲肠保持在管中，第二对圆形镊子将内容物推入管中（见视频1）。
    
    视频1
样品制备
1. 将500μl无菌PBS中的粪便添加到含1ml无菌PBS中的盲肠内容物的5ml试管中，最终体积为约1.5ml。如果低于这个体积，用额外的无菌PBS调整。
2. 在彻底均质化样品之前，清洗均质器在70％乙醇（见食谱）中冲洗1分钟两次，在无菌PBS中冲洗一次。
3. 使用匀浆器将无菌PBS中的粪便和盲肠内容物重新悬浮
4. 在室温下，将匀浆物在805×g（RCF）下旋转10分钟以沉淀并除去固体物质，并收集含有细菌的上清液。
口服灌胃
1. 来自供体的稀释的匀浆将通过口服灌胃直接施用到受体小鼠的胃中。稀释的盲肠内容物不会对动物的健康产生任何风险，因为老鼠通常吃自己的粪便。
2. 首先，动物被牢固地限制住头部。将鼠标保持在垂直（竖直）位置，并且将灌胃针轻轻地通过嘴的侧面，沿着嘴的顶部，并且通过食道前进到胃。重要的是要注意，针的整个长度必须插入鼠标，这将确认针进入食管而不是气管。
3. 针头通过正确的长度后，微生物将被注入。小鼠不需要禁食，小鼠体内给药量不会超过10毫升/千克。如果开始给药后动物出现任何痛苦迹象，应停止手术，并立即取下针头。如果材料已经注射到肺部（如果动物出现窒息的迹象），那么动物应该被安乐死。受体小鼠在接下来的24小时内休息。
4. 用200μl匀浆上清液重建受体GF小鼠
5. 在手术后不少于15分钟的时间内应该观察受体小鼠，并且在手术之后的每两天，每天观察疼痛或窘迫迹象，例如喘气，出血或口腔发泡。如果观察到这些迹象中的任何一个，则应该对小鼠进行人道安乐死。
6. 灌胃后，怀孕的GF接受者女性将独自留下2天的“请勿打扰”卡，并使用无菌食品，水和寝具安置在清洁的高压灭菌笼中。为了处理GF接受者，使用双手套并在层流罩中进行所有的工作。口服灌胃需要由技术熟练的人来完成，因为避免打乱母亲，导致她杀死幼崽是非常重要的。
7. 在怀孕的胚胎阶段E（13）（通过观察塞子测量），用怀孕的无菌NOD雌性受体小鼠接种第一次口服剂量的细菌混合物，并且当幼仔是2周龄时接受第二次口服灌胃。
8. 小狗将准备在21-24天断奶，并放在正常的食物和正常的水。类似于他们的母亲，3-4周龄的幼崽会在一天之内接受两次供体微生物群的灌胃。
9. 一旦来自接受者母亲的幼仔超过了他们的治疗期，他们将被监测糖尿病发作长达30周龄。通过检查血糖水平来进行糖尿病评估，如之前描述的（Marino等人，2009），连续两天记录连续两天以上记录的高于12mmol / L的记录，并且在组之间进行比较。结果的例子可以在（Marino ，2017）
  中找到

笔记

由于实验的性质，将重点放在尽可能准确地将捐赠者的微生物转移到受者身上，因此有必要尽可能避免外部污染。所有收集管和培养基都应该高压灭菌，样品在无菌环境中处理，所有的老鼠都在罩下工作。
供体小鼠应与受体小鼠的年龄和性别相匹配，以最大限度地减少导致微生物在饮食之外的差异的其他变量。
在实验开始之前，供体小鼠的共同住房对于在添加饮食以特定方式改变微生物群之前标准化所有小鼠的微生物群是重要的。
强烈建议在捐赠当天收集新鲜供体材料，因为微生物群的储存可能导致改变的细菌种群存在。在冰箱里储存可能会导致一些物种的生长，而另一些则保持不变，导致相对丰度不再代表肠道中的环境。同样，在冷藏室储存可能导致细菌死亡，再次改变相对人群。
处理样品时保持厌氧条件是理想的，但在实验过程中保持这一点是不切实际的。我们采取了尽可能多的实际步骤，例如使用新鲜高压灭菌的PBS，并尽量减少样品采集和灌胃之间的长度，尽量减少专性厌氧菌死亡。
我们发现进行多次灌胃期望的微生物群有助于确保期望的微生物群被有效地转移尽可能准确。因此，来自供体组的粪便样品的混合对于保持转移的微生物群是一致的是重要的。
进行口服灌胃的评估可以通过从管饲后的小鼠收集和培养粪便来观察以前的GF小鼠现在是否存在细菌。然而，确定灌胃成功的最好方法是通过分析接受者的微生物群与供体样本通过下一代测序相比较。

食谱

10倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）
80克NaCl
2克KCl
14.4克Na 2 HPO 4 4 2.4克KH 2 PO 4 4克/克通过将所有成分重新悬浮在蒸馏水中来制备10倍PBS以达到1L
用蒸馏水稀释10倍PBS制成1x PBS
高压灭菌1x PBS消毒和去氧新鲜PBS的实验
70％乙醇
在蒸馏水中稀释99％的分析级乙醇，浓度达到70％

致谢

这项工作得到了青少年糖尿病研究基金会（JDRF，3-2013-94），澳大利亚糖尿病研究信托基金（DART，项目资助Y14M1-MARE）的支持。我们要感谢H.Y.莫纳什大学的Y.Yap，C. McKenzie（Germ Free Unit，Walter＆amp; Eliza Hall医学研究所）和Monash University Animal Services（MAS）。竞争的财务利益：作者声明没有竞争的财务利益。

参考

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