材料和试剂

植物材料
1. 用于拟南芥幼苗垂直培养的方形塑料培养板（VWR，目录号：391-0444）
2. MS培养基+维生素（Duchefa Biochemie，目录号：M0222.0050），用于幼苗和细胞培养
3. 蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：84100）
4. 2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）（Euromedex，目录号：EU0033-A）
5. 萘乙酸（NAA）储备溶液（10毫克/毫升等分于-20°C）（西格玛奥德里奇，目录号：N064025G）
6. 激动素储备溶液（1mg / ml等分于-20℃）（Sigma-Aldrich，目录号：K3253）
7. 1 N KOH（用于pH）
8. MES（Euromedex）
9. 植物琼脂（Duchefa Biochemie，目录号：P1001.1000）
10. 细胞和幼苗的培养基（见方法1）
  1. 液体培养细胞的Murashige和Skoog培养基
  2. Murashige和Skoog苗种
高压冷冻（图2A）
1. Aclar sheet，51微米厚（Electron Microscopy Sciences，目录号：50426）
2. 低温管（VWR，目录号：479-1207）
3. Eppendorf 1.5毫升管（SARSTEDT，目录号：72.708）
4. 15毫升猎鹰管（SARSTEDT，目录号：62.553.542）
5. 牙齿选择
6. BSA部分V（Sigma-Aldrich，旧目录号：85040C，现在目录号：05482）
7. 液体MS培养基
8. 甲基环己烷（MCH）（Merck Schuchardt OHG 85662 Hohenbrunn，德国）
9. BSA在HPF期间的低温保护溶液（见方法2）
  
  图2.高压冻结过程A. 1.液氮浴中操作的绝缘镊子。 2. Leica加载系统（参见视频1了解加载步骤）及其相关的血小板保持杆。 3. 200微米深，1.5毫米直径的铜片。 4. 100微米深，1.5毫米薄膜载体，铜膜载体。 5.样品转移金属容器。 6.豆荚持有人。 7.豆荚。 8.哈里斯冲床用于生产1.5毫米直径的圆盘，可选择地放置在200微米深的血小板的底部以便于样品随后的分离。 9.扭矩螺丝刀用于拧紧吊舱中的膜载体（分别为＃3,4和5）。 B.显示机器状态的EMPACT1触摸屏的视图。（10）是控制从主罐（11）到液氮浴（12）的液氮流量的阀门。 C.处理样品后显示的视图。曲线下降是温度，曲线上升是压力。
冻结替代（图3）
1. 螺杆顶部2毫升管（SARDTEDT，目录号：72.693）
2. 一次性常规移液管1.5,2和3毫升和FS特定1毫升薄尖（Ratiolab，目录号：2600155）
3. Wheaton玻璃样品瓶，带有用于cryomix制备的snap-cap（DWK Life Sciences，WHEATON，目录号：225536）。
4. 个人墨盒半面罩6100（Honeywell International，目录号：1029471）
5. 塑料棺材或药丸徕卡模具（AFS2消耗品，徕卡，目录号分别为16707155和16707157）
6. 塑料溶剂容器与螺丝顶部（徕卡，目录号：16707158）
7. 锡箔
8. 乙酸双氧铀粉（Merck，目录号：8473）
9. 纯甲醇
10. 戊二醛10％EM级无水丙酮溶液（Electron Microscopy Sciences，目录号：16530）
11. 超纯100％乙醇和丙酮（VWR，目录号分别为83813.440和20066.558）
12. 四氧化锇小瓶0.1克（电子显微镜科学，目录号：19134）
13. 指甲油（颜色无所谓）
14. 低温取代醋酸铀酰储备溶液（20％）（见方法3）
15. 低温置换组合（见第4部分）
  
  图3.冻结替代程序 1. AFS管架。右边的是根据Heinz Schwarzes蓝图制作的（ heinz.schwarz@tuebingen.mpg.de ）。 2.用于容纳cryomix管的金属杯。 3.用于树脂聚合的模具容器的金属插座。 4.用于转移图1（＃5）所示管架1和2以及样品传输容器的螺丝刀。 EMS微针和泰德派拉公司的超微针工具。 6.泰德佩拉公司的微型工具适配器。 7.手工制作的刀架。 8.徕卡塑料“药丸”模具。 9.徕卡塑料“棺材”模具。 10.带螺纹顶部的塑料溶剂容器。 11. Leica塑料模具容器。
树脂嵌入
1. HM20树脂（Electron Microscopy Sciences，目录号：14345）
2. HM20％的解决方案（见第5章）
超薄切片
1. 结晶盘（Fisher Scientific，目录号：11766582）
  制造商：DWK生命科学公司，DURAN，产品目录号：213133408。
2. 快速吸收纸滤纸（Whatman，滤纸41）（GE Healthcare，目录号：1441-070）
3. 玻璃棒（Fisher Scientific，目录号：12441627）
  制造商：MBL，目录号：SRF380。
4. 具有不同网格（200L /英寸和300L / inch Delta显微镜）和槽格（EMS Formvar碳膜2×0.5mm铜网格批号，Electron Microscopy Sciences，目录号：EMS200-Cu）的网格
5. 石蜡膜（Bemis，Parafilm'M'）
6. 巴斯德吸管（VWR，目录号：612-1720）
7. 0.2μm过滤器
8. 注射器
9. 0.5毫升Eppendorf管
10. 5纳米胶体金溶液（BBI溶液，目录号：EM-GC5， www.bbisolutions.com ） />
11. 固体parlodion（电子显微镜科学，目录号：19220）
12. 乙酸异戊酯（Sigma-Aldrich，目录号：W205532）
13. 甲苯胺蓝粉末（Sigma-Aldrich，目录号：T3260）
14. 硼酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：B3545）
15. 超纯水（MilliQ）水
16. 2％Parlodion网格拍摄解决方案（见第6章）
17. 甲苯胺蓝溶液（见方法7）用于在树脂块研磨过程中在台式显微镜上筛查块状物部分
18. Fiducial标记解决方案（见方法8）

设备

植物材料
1. 200毫升的液体细胞培养玻璃瓶（Dutscher，目录号：232522）
2. 保持液体培养细胞运动的摇瓶振荡器（Digital Shaker，Southwest Science）
3. 用于体外培养幼苗和液体培养细胞的绿色室（参见配方1的生长条件）
高压冷冻（图2A）
1. 液氮，液氮容器和适应的个人防护装备
2. 空压机（JUN-AIR）
3. 徕卡EMPACT1机器（徕卡显微系统）
4. 徕卡加载系统
5. 豆荚持有人
6. 豆荚
7. 打孔机（Harri's微型打孔机1.20毫米）
8. 常规生物分子移液器从2μl到1,000μl范围
9. 200毫升的烧瓶
10. 双目根解剖（尼康，型号：SMZ-10A）
11. 加热表面可快速干燥豆荚和豆荚
12. 在N 2（VOMM Germany，22 SA ESD）中操作的绝缘镊子
13. 用于取样液体培养细胞的小金属筐。
14. 膜载体（100微米或200微米深）（徕卡显微系统，目录号分别为16707898和16706898）
15. 用于冷冻样品转移的金属容器和用于提升程序的相关螺丝刀（与EMPACT1一起提供）
16. 扭力螺丝刀（TOHNICHI，扭力螺丝刀RTD60CN）设定为30Ncm
冻结替代和树脂嵌入（图3）
1. 徕卡EM冷冻置换处理器（FSP）配有紫外线灯（徕卡显微系统）
2. Leica Automatic Freeze Substitution 2（EM AFS2）机器（Leica Microsystems，型号：Leica EM AFS2）
3. 手工制作的工具夹（用纸夹）可更好地处理AFS2井中的各种工具
4. AFS管架金属杯
5. 模具容器的金属插座
6. 用于从冷冻样品中分离膜载体并将样品正确放置在模具中的微型工具（微针＃1 0.025mm，Electron Microscopy Sciences，目录号：62091-01和钨5μm超微针，Ted Pella，目录号： 13625）
7. 通风橱
超微切开术（图4）
1. 各种大小的培养皿（Dutscher，目录号：068515,068516,068517）
2. 各种EM级精密镊子（EMS风格2，5，5X，风格7） https://www.emsdiasum.com/ https://www.dumonttweezers.com ）
3. 块持有人
4. 碳涂层机（可选）（SPI-MODULE碳涂层机）
5. 金刚石刀（DIATOME Trim20干，超湿和HISTO湿）
6. ELMO辉光放电器（可选）（CORDOUAN Technologies）
7. 玻璃刀制造商（LKB BROMMA，型号：7800刀制造商）
8. 第一步铣削玻璃刀到达样品
9. 电网运营商的网格存储
10. 徕卡Ultracut UC7（徕卡显微系统，型号：徕卡Ultracut UC7）
11. 用于粗块准备的剃刀刀片
12. 台式显微镜（奥林巴斯，型号：CX-41）
  
  图4.超薄切片手术 1.尖锐的刀片。 2.镊子（形状n°3，7，5和5X，EMS）。 3.网格持有人。 4.块座（与超薄切片机一起销售，徕卡显微系统）。 5.金刚石刀Histo，超45°的部分收集和修剪20干的精确修剪（从左到右）。 6.玻璃刀切割粗糙。 7.在网格收集步骤中，将猫须安装在木棒上进行截面收集。圆形插图显示了使用指甲油在棒上安装的猫须的放大视图。

软件

Tecnai成像和分析（TIA）软件（ https://www.fei.com/software/ ）
TEM用户界面与Tecnai成像和分析（TIA）软件结合使用来控制和获取EM的显微照片（ https ：//www.fei.com/software/ ）
Xplore3D（FEI）用于自动倾斜系列采集（ https://www.fei.com/software/）
ImageJ（ https://imagej.nih.gov/ij/download.html ）输入/输出插件（ http://www.cmib.fr/en /download/softwares/input-output.html ）用于读取.mrc倾斜系列文件和断层照片
IMOD套件（ http://bio3d.colorado.edu/imod/ ）

注意：所有处理都是使用IMOD套件完成的（Kremer et al。，1996）（从原始倾斜系列的对齐到断层图像重建，分割和数据分析。

程序

注意：此程序涉及操作危险化合物，即液氮，丙酮，四氧化锇，戊二醛，醋酸铀酰，Lowicryl树脂。如果您不熟悉如何处理此类化合物，请参阅官方指南和我们的注释1和2。

高压冻结
步骤A1至A13应尽可能快地进行以限制取样的活组织的恶化。就我们而言，这个时间不到一分钟。有关如何使用EMPACT1的详细说明，请参见用户手册以及概念论证（Studer）。 > 。，2001）。
1. 打开徕卡EMPACT和空气压缩机。
2. 使用MCH填充腔室，轻轻推动垂直杆，排出回路中的空气。
3. 填充液氮罐至¾（保持液氮源方便最终中途补足）。
4. 打开EMPACT1并等待工作压力达到4.8至5巴。
5. 在触摸屏上敲击相应的阀门，使液氮充满液体（图2B）。
6. 加载一个空的盒子，然后点击准备→锁定→ start 以进行拍摄，以清除系统中的所有空气。 />
7. 在徕卡加载系统（图2A，＃2和视频1）上装载薄膜载体。
  
  shipin1
8. 如果使用底部有孔的200μm薄膜载体，则用打孔器将生成的光盘楔入。冷冻固定前一天可以批量生产，在95％乙醇中温育，蒸发。
9. 用0.5-2μl移液器，在MS（Murashige和Skoog培养基）中用20％BSA（配方2）填充载体。它必须在插座上形成一个干净的圆顶，边缘没有流血，没有气泡（视频1）。
10. 处理生物材料：i）在MS培养基的双目下，用尖锐的刀片在玻璃载片上快速切下根，然后小心地用牙签捡起。 ii）将细胞等分在来自主200ml烧瓶的1.5ml Eppendorf管中，沉降数分钟。然后，通过用牙签或小金属勺形勺子从底部可见的绿色细胞颗粒刮取细胞，然后小心地将细胞置于膜载体中。每2至3次HPF试验（两名实验者牵连3分钟时间范围内），用新鲜细胞代替Eppendorf管中的细胞。
11. 将样品置于膜载体中的BSA气泡中。当样品完全被BSA淹没（视频1）时最好。
12. 将薄膜载体推入位于Leica加载系统（视频1）的专用插口中的盒子中。
13. （视频1），使用TORX螺丝刀（2.5 cN m -1 ）将蓝宝石紧固在托架上。
14. 拧上白色的豆荚夹（视频1）。
15. 将其装入Leica EMPACT机器和装载台，并将活塞向左推（视频2）。
  
  shipin2
16. 在触摸屏上点击准备→锁定→开始。该系统自动冲出容器支架，使装有样品的容器落入液体N 2浴中。
  在这个阶段，样品绝不能从液态N 2中冒出来，冒着突然失透和样品浪费的危险（视频2）。
17. 检查触摸屏上的冻结速度和压力升高。它应该如图2C所示，在达到最终温度之前最大压力达到〜20毫秒。
18. 把豆荚盒放在专门设计的插座里，放在液氮中（视频2）
19. 松开豆荚夹（视频2）。
20. 小心地松开蓝宝石的夹紧，然后轻轻地将薄膜托架轻敲在浴缸底部。
  使用绝缘镊子操纵冰冻膜载体（视频2）
21. 将膜载体放置在专用于此用途的样品载体中并保持在液体N 2（视频2）中。
22. 当所有样品准备好后续步骤转移时，将金属盖放在金属容器上，并迅速将容器从EMPACT槽转移到中间液氮容器中。然后转移到已经运行的AFS2机器，装满液体N 2并预冷至-90℃。
冻结替代
在冷冻取代过程中，始终保持冷冻水化样品在低温-80°C以避免过多的六角形冰（Dubochet，2007）非常重要。因此，绝对不要把管子从井中拿出来，总是使用预先在井内预冷15-20分钟的仪器，容器和FS溶液。
因为步骤B7到步骤B9是单调乏味的，所以我们建议在开始的时候花一整天的时间。
1. 在通风橱下，立即将锇加入螺旋管（用Sharpie编号并用透明胶带包裹以避免油墨冲洗掉）后立即调配低温混合物（见第4部分），然后将管浸入液氮中冷冻cryomix（冷冻时不易挥发）。
2. 将金属杯内的冷冻低温混合管插入AFS井中。
3. 当cryomix仍然是固体时，小心地将含有膜载体的冷冻样品放入cryomix管内（最多2个载体/管）。
4. 在从-195℃到-90℃过渡期的低温混合物解冻过程中，载体将沉淀在混合物中并开始冻结替代。
5. 设置AFS如下：
6. （可选但强烈鼓励）在FS开始之后的第1天，打开cryomix管并重新放置底部的载体，使得载体不会彼此重叠以最大限度地交换混合物和样品。此外，可以给管道轻微的摇晃。
7. 在-90°C至-50°C过渡完成后，机器保持在-50°C。
8. 每个试管用超纯丙酮彻底清洗3次，然后用超纯乙醇彻底清洗（注3）
9. 在最后一次洗涤过程中，将样品转移到含有100％乙醇的塑料模具容器中。
10. 使用微型工具（图3，＃5和＃6），将塑料模具容器中的样品从膜载体上小心分离。用它们刮擦载体的边缘，以放松冷冻的BSA。如果使用200微米深的载体（徕卡显微系统），可以使用底部的孔通过安装超微型针头工具（图3，＃5，右图）将冷冻样品推出。
11. 在用3ml移液管将分离的样品转移到模具中之前，用冷的超纯乙醇填充模具并让它们冷却到-50℃（注4）。
注意：在步骤B3到B8中，为了避免残余的四氧化锇的升华，应该在浴液之间始终关闭冷冻管。
树脂嵌入
1. 当所有样品放置在适当的模具中时，轻轻地从模具中吸出多余的乙醇（参见注3），并用25％的HM20代替（见方法5）。
2. 以下孵化动力只是一个指导原则。根据你的工作日适应：
3. 在最后的100％HM20浴中，将模具容器置于已经冷却至-50℃的金属片（图3，＃3）中，然后手动。
4. 安装FSP模块并设置AFS如下：
5. 从模具中取出硬化的树脂块，用刀片仔细切片，或者如果使用丸形模具，可以使用放置在底部的六角螺丝刀冲压块（视频3）。
  
  视频3
超薄切片
1. 网格拍摄
  因为我们将样品嵌入HM20 Lowicryl，这是一种比EPON更脆弱的树脂，所以这些部分需要放在涂有parlodion或formvar的网格上。
  购买Formvar涂层的狭槽栅格并且是有用的，因为没有栅格栅可能在高倾斜度下潜在地阻挡成像。但是，它们更脆弱，对树脂回缩引起的位移非常敏感。对于parlodion拍摄的网格，他们是自制的如下（视频4）：
  1. 填充一个结晶盘，放在一个大培养皿中，用蒸馏水
  2. 用玻璃棒将晶化盘的顶部架起来，使水面变平。
  3. 用巴氏吸管吸取parlodion溶液，并将移液管垂直放置在结晶皿上。让水滴落在水面上。
  4. 让parlodion散布在水面上。
  5. 使用夹子，取下第一层薄膜（用于消除潜在的灰尘和水面上的颗粒）。
  6. 重复步骤D1b和D1c。
  7. 小心地将网格放置在浮动的parlodion胶片上（不透明的一面朝下放在胶片上）。使用所需的网格（200目/μm 2对于更好的概述和倾斜系列采集是最佳的）。
  8. 用镊子，轻轻地放置一个沃特曼41型吸水纸（或相当的吸收速度）浮动网格，让它浸泡。
  9. 小心地将吸收性纸张上的多余的parlodion薄膜撕掉，或者将其折叠在浮动纸的顶部。这是为了防止多余的电影折叠到网格上，导致电影网格上的双层电影。
  10. 为了避免薄膜起皱和/或滑动，用2X5X型镊子（自动关闭）牢固地夹住吸收纸，并将吸收纸翻过来放入玻璃/塑料培养皿中。 />
  11. 让培养皿在通风橱下打开一天，以使拍摄的格栅变干。
  质量检查：在超薄切片机的双筒望远镜下，拿起拍摄的网格，通过反射在网格上寻找均匀的紫色眩光。透射电镜下，网格可能会显示一些小孔，这很好。但是，当发生很多孔时，parlodion溶液可能被水污染，可能需要更换。
  
  视频4
2. 部分收集
  1. 由于这个协议的目的是更关注如何处理样本，因为这是最终图像的关键因素，所以我们不会详细讨论如何正确使用超薄切片机，准备切割块面。等等相反，请参阅Hagler（2007）。以下是正确执行这些步骤的一些意见。
  2. 对于PD的研究，用Leica Ultracut UC7（Leica Microsystems）收集90nm或180nm厚的切片。
  3. 生成序列部分可能是有用的，主要有两个原因：1）有一个网格，更多的感兴趣的对象; 2）串行层析成像可以在连续部分重建相同的结构的情况下执行，使得有可能恢复结构的3D体积大于切片厚度（Kang等人，2011年）。
  4. 要做到这一点，块面需要足够小，以便多个部分可以放在一个网格上。以梯形形状雕刻块体表面将允许各部分在产生时粘在一起，从而形成连续的部分的连续带，其可以容易地同时沉积在单个网格上。
  5. 虽然在使用非碳酸盐化磷酸铜铜网格时通常不会出现问题，但是如果在收集步骤中由于静电导致栅格被栅格排斥，栅格可以在截面收集之前被辉光放电。
  6. 根据EM电压（更多的电压等于更多的电子动能，因此更好的成像厚样本的能力）和感兴趣的结构的大小，部分的厚度可以从90nm到180nm变化。更接近90nm厚度的更细的部分将产生稍微更好的x，y分辨率，特别是在我们的情况中，在中等范围的EM电压下。 180纳米和更大，将允许更好的体积恢复，牺牲x，y分辨率时，在120千伏的成像。在PD研究的情况下，简单的直径范围从20到40nm厚，所以90nm厚的切片是合适的。但是，必须注意的是，PD可以具有不同的长度和大小，特别是当涉及分支的复杂PD时。因此它们可以在所有方向上跨越细胞壁延伸到几百nm。在这种情况下，增加切片厚度可以更好地恢复毛孔的体积。
3. 具有基准标记（金颗粒）的涂层网格
  金颗粒被用于在断层图像重建之前所需的后续对准步骤。由于纯胶体金由于其固有的负电荷而倾向于聚集，因此通常使用经BSA稀释的金，使金的扩散在整个部分更均匀。
  1. 在一张石蜡膜上，铺上金溶液（见方法8）和水（图5）。
  2. 轻轻地将网格放在黄金滴上，持续20秒左右
  3. （可选）轻轻地上下吸取混合物，以利于电网与金的良好接触。
  4. 在两个水滴上依次放置网格几秒钟以去除多余的金溶液。
  5. 通过接近网格侧面的吸水纸（沃特曼纸5级）吸收剩余的液体。
  6. 在网格的另一侧重复步骤D3a至D3e，以便在两侧都有金颗粒。
  7. 在电磁场引入之前让电网干燥（否则会损坏离子泵系统）
    
    图5.在网格上放置基准标记。在层析成像之前，网格上的基准标记沉积的典型设置。首先将网格放在红色滴剂（基准标记+ BSA溶液）上15-20秒，然后在水滴中连续拖动，并用吸水纸在格栅边缘小心地干燥。这个过程需要在网格的两边重复。

数据分析

利用这种高压冷冻 - 冷冻取代方案，细胞内纳米细节的形态学研究成为可能。结合使用Lowicryl HM-20树脂，更脆弱，更电光，并能够在低温下（与紫外线）聚合，这个协议允许有效的层析重建细节约10纳米的维度。低倍图像显示保存良好的细胞团（图6A）。在这些细胞之间的界面处，看到PD桥接细胞（图6B）。倾斜系列采集一个典型的I型孔隙（视频5）呈现出可以欣赏到整个孔隙体积的层析图（图6C-6E和视频6）。

视频5

视频6

图6.在HPF和FS后获得的代表性数据A.用本文描述的程序处理并用于（Nicolas等人， 2017b）。（A）中的红色方框区域中发现的I型等离子体模型（红色箭头）的倾斜系列的0°倾斜。截面厚度：180 nm。（B）中显示的0.56nm厚的胞间连丝断层切片。左侧和右侧显示了ER可以看到的毛孔的两个末端（红色箭头）。 D.用IMOD实现的分割，具有相同的胞间连丝。 E.（C）中的等离子体断层的层析切片在一个平面上具有全长。用3DMOD的切片工具完成。
该协议还成功地提供了植物细胞器如脂滴和高尔基体的清晰快照（Wattelet-Boyer等人，2016; Brocard等人，2017）
生物复制和独立实验：
PD计数和PD断层扫描至少在两个生物学重复上进行，如果可能的话三个重复。对于培养的细胞，一个生物复制品在特定的日期构成一个独立的高压冻结阶段。事实上，因为培养的细胞通常在同一个烧瓶中进行采样，所以我们没有考虑来自相同HPF的不同块体作为生物学重复。
对于根，每个幼苗被认为是一个个体，因此被认为是生物复制。然而，来自根源的数据也是在多个HPF会议上收集的。
PD筛选方法：
在（Nicolas等人，2017b）中，计数I型与II型毛孔遵循体视学的基本原理（Lucocq，1993）。它们是：i）避免重复计算毛孔，ii）建立关于什么时候PD可以包含在数据中的精确规则。重要的是要强调，这种一般的方法可以用来计算其他功能PD（简单与分支例如）和其他细胞器。
ⅰ）当依序连续的部分时，重复计算结构的内在风险会跨越多个部分。这种风险随着感兴趣的结构的大小而增加。因此，需要适合感兴趣对象大小的精确计数协议。
首先，评估在多个连续部分上遇到给定结构的“机会”。结构被发现在'参考'部分（n）上，然后我们评估这些相同的结构是否仍然存在于'查找'部分（n + 1））。如果结构不在那里，就说它是“解决了”（图6）。然后可以根据感兴趣的对象的大小和截面厚度来计算第n + 1节，第n + 2节等等的解析特征的分数。
在最宽40nm的PD的情况下，它们大大劣于截面厚度。因此，在培养细胞的n + 1切片（Nicolas等人，2017b图3g）中，筛选的80％孔隙在n + 1节解决。因此，通过计数每2个切片（n，n + 2，n + 4等），我们可以合理避免PD的重复计算。
ii）当两个质膜可见并且PD连接两个相邻的细胞中的至少一个（图7）时，将PD计数为“有效”并包括在数据中。

图7.连续部分的PD计数 A.卡通描述了网格上的4个连续部分。感兴趣的结构被发现在参考部分n上，然后在查找部分n + 1，n + 2 etc 之后。当不能再看到结构的时候，据说就解决了。（B-C）通常收集用于定量的I型PD（左）和II型（PD）的90nm厚切片的显微照片。毛孔的膜是可见的，并且它们与两侧连接。在后者中，孔内的异质密度允许细胞质套间隙（白色箭头）的可视化。尽管不像层析成像那样具有分辨力，但可以看到中心元素（desmotubule）横跨中心的孔隙。

笔记

液氮操纵
由于液氮可以燃烧，因此在液氮容器的操作过程中，请始终佩戴适当的眼睛/脸部保护装置，手部保护装置和实验室涂层。
由于这种气体会导致窒息，请务必确保房间通风良好。
低温取代试剂和树脂
戊二醛和乙酸双氧铀溶液必须在-20°C储存在一个单独的容器中。
应将四氧化锇分开存放，最好放在通风橱中，并始终使用特殊的实验室手套（SHIELDskin Orange nitrile 250）进行操作。当cryomix在通风橱外进行操作时，在进行cryomix的过程中，实验者（和其他在同一个房间里的人）应该有完整的保护，包括实验室手套，实验室墨盒面罩（SPERIAN半面罩和T48-ABEK1 P3双墨盒）和防护眼镜，以避免与四氧化锇烟雾接触。
HM20和任何其他种类的树脂也应该用手套和墨盒面罩进行操作。为了方便起见，我们在从FS开始到树脂聚合的所有步骤中穿着完整的防护装备。
总的来说，所有这些化合物，包括丙酮，都应该使用实验室手套随时操作。
手套应该每20分钟更换一次，并在受到污染时立即更换
在低温取代期间改变浴的建议
FS期间更换浴缸必须小心谨慎，耐心。用薄吸头1毫升吸取轻轻吸出以前的培养基（防止意外吸入样品）。在此步骤中，避免吸入和吸出。湍流可能会从运营商分离样品。请始终在底部留下剩余的介质，以防止样品空气干燥。然后用一个普通的塑料吸管（无论大小）轻轻地添加下一个媒介，让它滴在塑料管壁上。
样品在模具中的明确追踪
保持准确的跟踪什么样品/条件是在哪个模具，以避免任何歧义。
模具可以用多种形状/点的彩色指甲油标记，以区分它们。

食谱

培养基为细胞和幼苗
1. 液体培养细胞的Murashige和Skoog培养基（1 L）
  Murashige和Skoog中等+维生素（Duchefa Biochemi）：4.41g
  蔗糖：30克
  2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）（Euromedex）：0.5g
  NAA：50微升
  激动素储备液：50微升
  用1N KOH溶液调节pH至5.8
  高压灭菌瓶110°C 30分钟
  注：细胞在恒定光照（20μE/ m / sec）下培养，并在22°C恒定搅拌。
2. 苗（1升）Murashige和Skoog培养基
  Murashige和Skoog中+ vits（Duchefa Biochemi）：4.4克
  MES（Euromedex）：0.5克
  植物琼脂（Duchefa Biochemi）：7克
  用1N KOH溶液调节pH至5.8
  高压灭菌瓶110°C 30分钟
  注：在垂直放置的培养皿中培育幼苗，以便在长日照时间（16 h，100μE/ m / sec）下，在22°C的温室中使根停留在培养基表面上。 / em>
在HPF（2毫升）期间用于冷冻保护的BSA溶液
称量0.4克BSA，并将其放入15毫升Falcon管中用2毫升的液体MS培养基培养细胞（见方法1）
彻底漩涡，直到BSA完全溶解
在-20°C储存
低温取代醋酸铀酰储备液（20％，500μl）
称取0.1g醋酸铀酰粉末（需要手套和防尘面罩）并放入2ml螺旋管中加入纯甲醇（通风橱下）至500μl
将管子包裹在锡箔中，置于-20℃的专用低温置换箱中避光保存
Cryosubstitution混合
不同浓度的HM20％溶液（4毫升）
在FS Leica塑料溶剂容器中制造HM20溶液（图3，＃10）。在使用前在-50°C下预先制备溶液并预先在AFS中预冷
2％Parlodion网格拍摄（20毫升）
称重0.4克固体parlodion（电子显微镜科学）
加入乙酸异戊酯（储存在通风的溶剂柜中，远离湿气）最多20毫升
搅拌，直到固体parlodion溶解
将烧瓶包裹在锡箔中，并用Parafilm
密封盖子
甲苯胺蓝溶液
制备母液：在20ml蒸馏水中加入1g甲苯胺蓝粉末（Sigma-Aldrich）和1g硼酸钠（Sigma-Aldrich）
工作溶液在蒸馏水中稀释25倍
Fiducial标记解决方案
在MilliQ水中制成0.5％BSA溶液
用0.2μm过滤器连接到注射器的滤液
混合0.5％BSA胶体金溶液（1：1比例）
分装在0.5 ml Eppendorf管中，-20°C保存

致谢

这项工作得到了阿基坦大区（E.M.B）和PEPS（对E.M.B的初步探索性项目支持）和国家研究机构（授予E.M.B的ANR-14-CE19-0006-01）的支持。所有的样品制备和成像都是在波尔多成像中心附上的PôleImagerie duVégétale上进行的（ http：/ / /www.bic.u-bordeaux.fr/ ）。阿基坦大区还支持收购电子显微镜（授权号：2011 13 04 007 PFM）。感谢ClémentChambaud协助制作说明性视频。作者声明没有利益冲突。

参考

Brocard，L.，Immel，F.，Coulon，D.，Esnay，N.，Tuphile，K.，Pascal，S.，Claverol，S.，Fouillen，L.，Bessoule，JJ和Brehelin，）。来自拟南芥的脂质微滴的蛋白质组学分析老化的叶子带来了新的洞察生物发生和功能。

正面植物科学8：894.
Ding，B.，Turgeon，R.和Parthasarathy，M.V。（1992）。冻结取代的胞间连丝的子结构原生质 169：28-
Donohoe，B. S.，Mogelsvang，S.和Staehelin，L. A.（2006）。 ER，高尔基体和相关膜系统的电子断层扫描。
39（2）：154-162。
Dubochet，J。（2007）。快速冷却的物理学及其对冷冻细胞的影响方法Cell Biol 79：7-21。
Hagler，H.K。（2007）。用于生物电子显微镜的超薄切片。在：Kuo，J.（Ed。）。电子显微镜：方法和协议。 Humana Press pp：＆nbsp; 67-96。
Kang，B.H.，Nielsen，E.，Preuss，M.L.，Mastronarde，D。和Staehelin，L.A。（2011）。拟南芥中的RabA4b-和PI-4Kβ1标记的反式高尔基体网格室的电子断层扫描< / em>。流量 12（3）：313-329。
Kremer，J.R。，Mastronarde，D.N。和McIntosh，J.R。（1996）。使用IMOD进行三维图像数据的计算机可视化 J Struct Biol 116（1）：71-76。
Lucocq，J。（1993）。细胞生物学超微结构的无偏三维定量趋势细胞生物学 3（10）：354-358。
Nicolas，W. J.，Grison，M. S.和Bayer，E. M.（2017a）。形成胞间连丝的细胞间通道：结构与功能的缺失环节 J Exp Bot 。
Nicolas，W. J.，Grison，M. S.，Trepout，S.，Gaston，A.，Fouche，M.，Cordelieres，F. P.，Oparka，K.，Tilsner，J.，Brocard，L.and Bayer，E.M。（2017b）。胞质分裂后胞间连丝的构建和通透性缺乏细胞质套管 Nat植物 3：17082。
Oparka，K.J。和Roberts，A.G。（2001）。 Plasmodesmata。一个不那么开放的案例。植物生理学125（1）：123-126。
Studer，D.，Graber，W.，Al-Amoudi，A。和Eggli，P。（2001）。高压冷冻冷冻固定的新方法 J Microsc < 203（Pt 3）：285-294。
Tilney，L.G.，Cooke，T.J.，Connelly，P.S。和Tilney，M.S。（1991）。通过质壁分离，洗涤剂提取和蛋白酶消化显示的胞间连丝结构 < J细胞生物学 112（4）：739-747。
Wattelet-Boyer，V.，Brocard，L.，Jonsson，K.，Esnay，N.，Joubes，J.，Domergue，F.，Mongrand，S.，Raikhel，N.，Bhalerao，RP，Moreau，P.和Boutte，Y.（2016）。羟基化的C24-和C26-酰基链鞘脂的介导在跨高尔基体网络中介导PIN2顶端分选子域名。 Nat Commun 7：12788。