材料和试剂

用铂丝制成的蜗杆（Tritech Research，目录号：PT-9901）
滤纸（110mm直径）（GE Healthcare，Whatman，目录号：1001-110）
直径140毫米的培养皿（VWR，目录号：391-1500）
90毫米培养皿（Techno Plas，目录号：S9014UV20）
℃。线虫株
以下方案适用于源自野生型动物（N2，布里斯托尔菌株）的菌株。建议的对照（可从Caenorhabditis遗传中心（CGC）获得）：
1. N2（野生型）：阳性对照
2. gcy-31（ok296）：无法响应O 2 级别的降档
3. gcy-35（ok769）：无法响应O 2 级别的升级
4. gcy-9（n4470）：无法回应CO <2>浓度的变化
5. 税4（p678）：O 2和CO 2感应不足
注意：所有菌株都应在标准条件下培养和保存（Brenner，1974）。所有的菌株应该与野生型动物杂交至少4次。温度或饥饿的变化会影响测定结果。因此，菌株应该保持在恒定温度（通常20℃），并且在测定之前用OP50大肠杆菌充分喂养至少两代。
氯化铜（II）二水合物（CuCl 2•2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：221783-100G）
用OP50 E播种的NGM维护板。（见食谱）
KPO 4缓冲液（1M，参见食谱）
1. 磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P0662-500G）
2. 磷酸二氢钾（KH 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：3786-500G）
测定NGM板（参见食谱）
1. 氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653-250G）
2. 琼脂（SERVA高凝胶强度琼脂）（SERVA电泳，目录号：11396.03）
3. 胆固醇（Sigma-Aldrich，目录号：C8667-25G）
4. 氯化钙（CaCl 2）（Merck，目录号：1.02382.0500）
5. KPO缓冲液（1M）
饥饿板（见食谱）

设备

电脑与软件兼容
英特尔酷睿i7,32GB内存，Windows 7,64位。需要一个额外的千兆以太网卡来连接GigE摄像机（图1）
相机
我们使用一个400万像素CCD相机（JAI，型号：BM-500GE），35毫米物镜：QIOPTIQ MEVIS 3516.延伸环：扩展环1（1毫米C型安装）（图1）

图1.计算机和相机设置
流量控制器
Vgtgt仪器，CO 2：GSC-A9TA-BB21 50mln / min，N 2：GSC-A9TA-BB22 200mln / min，O 2： GSC-A9TA-BB21 50 mln / min（图2）

图2.气体和流量控制器设置：一种。连接到流量控制器的主电源总览。 B.流量控制器的特写。
LED照明（CCS，目录号：TH-211 / 200RD），电缆（CCS，目录号：FCB-1），电源（CCS，目录号：PD2-5024）
个别气瓶为O 2，CO 2和N 2
注意：也可以使用预混瓶，具体取决于所使用的流量控制器。尽管如此，我们还是建议使用单独的气瓶，因为它们可以对可测试的气体参数提供灵活性。
检测室：定制透明有机玻璃装置，流动空间为60 x 60 x 0.7 mm（图3）

图3.定制设计的化验室。：一种。顶部图：从顶部看。底图：侧视图。注意图表没有被缩放。 B.从上面拍摄的化验室的照片。
高压灭菌器
干燥机（粘结剂，目录号：9010-0102）
500毫升高压灭菌瓶

软件

Labview（编程和调节流量控制器）
MATLAB（R13）（MathWorks）和图像采集与图像处理工具箱（图4）
并行WormTracker（免费提供： https://sourceforge.net/projects/wormtracker/ ） >
Streampix软件（Norpix）

图4. WormTracker分析的截图。：一种。由软件检测到的单个蠕虫轨迹（红线）。 B. MATLAB分析软件屏幕显示跟踪帧。

程序

C的增长和同步。线虫人群
建议：对于每个品系，每天挑选4个幼虫阶段4（L4）雌雄同体到4个维护板上（每板4个蠕虫），并且在测定中使用下一代：对于转基因染色体外菌株，应该挑选超过4个转基因L4以确保足够的转基因蠕虫可用于测定。另外，对于小于野生型的突变体，必须选择更多的蠕虫进行同步。
选择大约150L4 /年轻的成虫到饥饿平板（不用OP50大肠杆菌接种）。因此，细菌不会转移到空盘子，不要选择使用细菌，而是使用蠕虫挑选作为一个勺子来传播爬出细菌草坪蠕虫。
注意：蠕虫不应该用M9缓冲液冲洗掉，因为行为分析对压力非常敏感。
让蠕虫挨饿1小时。饲喂状态强烈地影响对O 2和CO 2的行为反应，因此，对于每个测试的菌株，饥饿必须进行相同的时间长度。此外，良好喂养的N2蠕虫对O 2（Zimmer等人，2009）中的降级无效。
准备测定板（图5）
1. 在Whatman滤纸的中心切一个56×56平方毫米的面积（可以使用打孔机）。
2. 将滤纸置于行为测定板（14cm NGM测定板）上。
3. 将滤纸浸泡在20 mM CuCl 2 2的正方形边缘，以便在检测区域内检测到蠕虫。
  
  图5.分析板的图示。 14cm NGM测定板包含浸泡在700μl20mM CuCl 2中的Whatman滤纸的56×56mm的竞技场。
  。雌雄同体被放置在舞台上，化验室被仔细定位在板的顶部。
将饥饿板上的蠕虫勺到试验板的中心。
注意：注意不要伤害琼脂，因为蠕虫会挖洞。
将分析室放在分析板的顶部。
蠕虫所在的56×56平方毫米正方形内部很重要
将燃气管连接到燃烧室，启动大气浓度的气体流动（或者根据您所需的启动条件）。在开始实验之前让气体流动至少5分钟。
在运行选定的气体浓度测试时录制视频。
2 和CO 2 > 感测，用N 2 平衡浓度。为了测试急性感觉，我们建议每种情况的下列时间：6分钟21％O 2 / 79％N 2 -6 min 10％O 2 / 90％N 2 -6分钟21％O <子> 2 / 79％N <子> 2 。为了测试急性感应，我们建议每种情况的下列时间：6分钟21％O 2 / 79％N 2 -6分钟21％O <子> 2 / 78％N <子> 2 / 1％CO

数据分析

平行的WormTracker软件包包括一个详细的用户手册，描述如何运行它从视频中提取必要的数据（Chalasani et al。，2007; Ramot et al。，2008）。说明脚本可以更新到不同的操作系统和视频格式是很重要的。最初的脚本是为运行Windows XP的PC和AVI格式的未压缩，灰度（8位）电影而编写的，分辨率为640 x 480.WormTracker识别蠕虫并跟踪蠕虫质心定义的位置。在录制视频之后进行跟踪。蠕虫跟踪后，Wormanalyzer允许分析轨道和检测蠕虫的速度和其他参数，如转弯事件。这些数据可以用任何标准的统计软件如GraphPad Prism来提取和进一步分析。

代表性数据
当野生型雌雄同体在O 2水平上发生变化时，它们会降低速度并改变方向。使用人口行为分析，我们在这个协议中描述了这些速度的变化是如何测量的，以便能够评估蠕虫种群的气体感应能力。我们以前使用这些测定来确定在气体感应神经元的发展所需的多种转录因子的功能重要性。（Brandt等人，2012; Gramstrup Petersen等人，2013; Rojo Romanos 等人，2015）和2017年）。在图6中，我们举例说明了获得的结果：我们展示野生型蠕虫如何响应BAG神经元降档（21％-10％）或URX神经元介导的升高（10％-21％）而降低其速度在O 2浓度下（图6A）。相反，缺乏LIN-32 / Atoh1转录因子并且在URX发育中具有缺陷的突变动物lin-32（ tm1446 ）未能响应O 2浓度从10％升高至21％的升高（图6B）（Rojo Romanos等人，2017）。最后，其中EGL-13 / Sox转录因子被删除的突变体动物egl-13（ku194）突变体动物未能响应于O 2浓度的升高和降档到BAG和URX神经元规范的缺陷（图6C）（Gramstrup Petersen等人，2013）。

图6.线虫突变体不能响应O 2 水平的变化。（B）和（egl-13）（ku194）的运动速度的图表显示野生型（A），（C）突变动物，当O 2水平每6分钟移动一次时：21％-10％-21％。数据表示至少四次独立测定的平均值（每个测定80-120个动物）。突变体对O 2升高（URX-但是对于野生型动物对O 2降档（BAG介导的）表现出类似的响应。相比之下，egl-13（ku194）突变体动物由于BAG和URX规格的缺陷而不能响应O 2升档和降档。红色箭头表示O 2水平变化的缺陷响应。

食谱

维护板
见他（2011）
KPO <4>（1M）
制备KH 2 PO 4（Sigma-Aldrich）和K 2 HPO 4（分别为Sigma-Aldrich）的单独1M溶液西格玛奥德里奇）
过滤灭菌两种溶液并测量434ml 1M KH 2 PO 4和66ml 1M K 2 HPO 4在转移到一个500毫升的高压灭菌瓶之前使用高压灭菌的量筒。
测定NGM板（22 g / L琼脂）
使用14厘米板（VWR，培养皿140毫米直径）
1. 对于1升NGM：
  3克NaCl
  22克琼脂（SERVA高凝胶琼脂）
  1毫升胆固醇（5毫克/毫升）（高压灭菌后添加）
  1毫升CaCl 2（1M）（高压灭菌后加入）
  25 ml KPO 4（1 M）（高压灭菌后添加）
2. 将精确的75毫升NGM溶液倒入每个14厘米的平板中，使其固化在一个稳定且完美的平坦表面上
3. 当琼脂是固体时，用薄纸去除凝结在盘子盖子上的残余水。
4. 在干燥器（Binder）中将板干燥至50°C 24小时，盖子朝下
5. 从烘干机中取出印版，用纸巾清除印版盖上的残留水分
6. 在室温下放置一天
7. 直接使用这些盘子进行行为实验，或将它们存放在冷藏室/冰箱中长达30天
注意：不要用细菌对这些平板进行播种。对于一个实验，使用从同一批NGM中倒出的板，并允许干燥相同的时间。
饥饿板（17克/升琼脂）
使用9厘米板（90毫米培养皿，Techno Plas）
对于饥饿平板，使用与测定平板相同的配方，但每升含17克琼脂（而不是每升22克）。
注意：不要用细菌对这些盘子进行播种。

致谢

本研究中使用的一些菌株由美国国立卫生研究院基础研究计划办公室（P40 OD010440）和国立日本生物资源项目（日本）的三井昌平提供资金的Caenorhabditis遗传中心提供。这项工作得到了欧洲研究理事会（ERC起始拨款号码260807），莫纳什大学生物医学发现奖学金和veski创新研究金的资助：VIF 23到RP。该协议已经改编自（Zimmer等人， 2009年; Rojo Romanos等人，2017年）。利益冲突声明：作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

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Brenner，S。（1974）。的遗传学 Caenorhabditis elegans 。 Genetics 77（1）：71-94。
Bretscher，A.J.，Kodama-Namba，E.，Busch，K.E.，Murphy，R.J.，Soltesz，Z.，Laurent，P.and de Bono，M。（2011）。温度，氧气和盐敏感神经元 C。 elegans 是控制回避行为的二氧化碳传感器。 Neuron 69（6）：1099-1113。
Chalasani，S.H.，Chronis，N.，Tsunozaki，M.，Gray，J.M。，Ramot，D.，Goodman，M.B。和Bargmann，C.I。（2007）。在秀丽隐杆线虫。 450（7166）：63-70。
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Ramot，D.，Johnson，B.E.，Berry，T.L.，Jr.，Carnell，L。和Goodman，M.B。（2008）。并行蠕虫跟踪器：一种测量线虫平均速度和药物诱导的麻痹的平台。 PLoS One 3（5）：e2208。
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Rojo Romanos，T.，Pladevall-Morera，D.，Langebeck-Jensen，K.，Hansen，S.，Ng，L。和Pocock，R.（2017）。 LIN-32 / Atonal控制氧气感应神经元发育秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）。 Sci Rep 7（1）：7294。

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