材料和试剂

Eclipse吸头（Labcon，目录号：4-1011-260-000，20μl吸头，4-1018-260-000，200μl吸头，4-1019-260-000，1200μl μl提示）
1厘米光路比色皿，聚苯乙烯/聚甲基丙烯酸甲酯（VWR，目录号：634-0676）
Nunc96孔平板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：249946）。
15毫升Falcon管（Greiner Bio One International，目录号：188271）
1.5 ml Eppendorf安全锁定微管（Eppendorf，产品目录号：0030120086）
1.5毫升Eppendorf微管（Eppendorf，目录号：0030125150）
1.5ml Nalgene TM螺旋盖微量离心管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：342800-0020）
在含有1.5％（w / v）乙酸的A +平板（Stevens等，1973）平板上生长的聚球蓝细菌7002的培养物， BD Bacto TM脱水琼脂（BD，Bacto TM，目录号：214050）
在含有1.5％（w / v）BD Bacto TM TM的BG11培养基（Stanier等人，1971）的平板上生长的集胞藻6803的培养物，脱水琼脂（BD，Bacto TM，目录号：214050）
液体培养基（Stevens等，1973）
BG11培养基，液体（Stanier等人，1971）
B-PER TM TM细菌蛋白质提取试剂（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：78248）
20mM Tris-HCl缓冲液，pH7.5
UltraPure TM Tris盐酸盐[三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐]（Tris-HCl）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15506017）
96％（v / v）乙醇（Plum，目录号：201104）
1M碳酸氢钠（NaHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
Micro BCA TM蛋白质分析试剂盒（Thermo Fisher Scientific）
不含乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，Roche Diagnostics，目录号：04693116001）的c omplete TM蛋白酶抑制剂混合物。
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）
磷酸肌酸（Sigma-Aldrich，目录号：P7936）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
NADH（Sigma-Aldrich，Roche Diagnostics，目录号：10107735001）
1,5-二磷酸核酮糖（Sigma-Aldrich，目录号：83895）
甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Sigma-Aldrich，目录号：G2267）
3-磷酸甘油磷酸激酶（Sigma-Aldrich，目录号：P7634）
肌酸磷酸激酶（Sigma-Aldrich，目录号：C3755）
三（羟甲基）氨基乙烷马来酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：T3128）
（Sigma-Aldrich，Roche Diagnostics，目录号：10128058001）
葡萄糖-6-磷酸（Sigma-Aldrich，Roche Diagnostics，目录号：10127647001）
不含乙二胺四乙酸（EDTA）的cOmplete TM蛋白酶抑制剂混合物（见食谱）
缓冲区A（见食谱）
Rubisco检测缓冲液（见食谱）
G6PDH检测缓冲液（见食谱）

设备

玻璃管（内径1.9厘米，最大容积约40毫升）
P10 Finnpipette TM F2固定体积单通道移液器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：4642010）
P20 Finnpipette TM F2固定体积单通道移液器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：4642060）
P200 Finnpipette TM F2固定体积单通道移液器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：4642080）
P1000 Finnpipette TM F2固定体积单通道移液器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：4642090）
-20°C冷冻机
Hiclave TM高压灭菌器（HMC欧洲）
对于集胞藻6803，温度设定在30℃的水族箱，对于集合球菌7002设定为37℃的水族箱 7002
Philips Master TL-D，18W / 840冷白色荧光灯管（Philips Lighting Holding，目录号：871150063171840）。调节荧光管的数量以获得对于集胞藻6803和200μmol光子的50μmol光子m 2 / s -1的光子通量对于聚球蓝细菌7002来说，m -2 -1
GMS150气体混合器（Photon Systems Instruments，目录编号：GMS150）提供3％（v / v）CO 2与空气平衡
Holten水平层流气流无菌工作台（Thermo Fisher Scientific，型号：Holten水平层流气流清洁工作台）
QRT1 Quantitherm光度计/温度计（Hansatech Instruments，型号：QRT1）
Ultrospec 3100紫外/可见分光光度计（GE Healthcare，Amersham Biosciences，型号：Ultrospec 3100 pro ）
2-L烧瓶
Sorvall TM RC 6 Plus离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：Sorvall TM RC 6 Plus，目录号：46910）
注：此产品已停产。
PSU-20i多功能轨道振动平台（Grant Instruments，型号：PSU-20i）
带有SoftMax Pro软件的SpectraMax 190酶标仪（Molecular Devices，型号：SpectraMax 190，目录号：190）
Eppendorf ThermoMixer®C（Eppendorf，型号：ThermoMixer®C，目录号：2231000269）
用于1.5ml Eppendorf管的冷冻台式离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Sorvall TM Legend TM Micro 17，目录号： 75002430）

软件

Excel（Microsoft Office）
SoftMax Pro软件（见上面的供应商）

程序

蓝藻的培养
1. 为了进行预培养，将来自平板培养的蓝细菌细胞的少量（大约大小的稻谷颗粒）转移到10ml液体培养基中。在恒定供应的3％（v / v）CO 2与空气平衡的情况下，在水族箱中培养预培养物（参见设备，参见图1）24小时。使用A + 培养基和BG11培养基分别培养聚球蓝细菌7002和集胞蓝细菌6803。
2. 将1ml培养物转移到具有1cm光程长度的塑料比色皿中，并使用分光光度计测量730nm处的光密度（OD 730）。如果该值高于0.8，则进行适当的稀释，直到值落在0.1和0.8之间。然后计算未经稀释的培养物的OD 730值。
3. 用新鲜培养基稀释预培养物，使得10ml体积中的OD 730达到0.05。培养培养物直到OD 730达到大约1.在这个阶段，细胞处于指数生长后期。
注意：
1. 通常，制备三种独立的培养物作为每种条件的生物学重复。条件的实例是不同的基因型（例如野生型菌株，突变菌株），营养方案（例如剥夺微/大营养素）和环境设置（例如光强度，温度，pH）。
2. Synechococcus 7002和Synechocystis 6803培养物需要的持续时间从OD 730 1达到OD 0.05的条件取决于条件，但是在本方案中描述的培养装置中通常分别约20小时和约40小时。
3. 文化体积可以根据需要进行调整。我们在2L烧瓶中测试1L，在96孔板中测试200μl。
图1. 10 ml蓝藻培养物的培养，通透性和酶活性测定方法示意图
蓝细菌细胞渗透性
对程序A中制备的每个生物学重复进行以下步骤。
注意：
1. 请参阅过程A中的注释a
2. 所有的步骤都在冰上进行。
3. 见图1
1. 准备以下解决方案，并在冰上储存，直到使用：
  1. 含有蛋白酶抑制剂的B-PER TM TM试剂：向1ml B-PER TM TM试剂中加入40μl25xcOmplete蛋白酶抑制剂溶液（参见配方） >
  2. 含有蛋白酶抑制剂的20mM Tris-HCl缓冲液（pH7.5）：将20μl25xcOmplete蛋白酶抑制剂溶液加入到0.5ml Tris-HCl缓冲液（20mM，pH7.5）中。
2. 将步骤A3中制备的10ml培养物转移至15ml Falcon管中，并在4℃下以5,000xg离心10分钟。丢弃上清液。
  注意：当使用较大的培养体积（例如1L）时，容量更大（≥200ml）的离心瓶适用于收集细胞。当使用96孔板培养时，可以在多孔板离心机中直接离心。
3. 将沉淀重悬于1ml含步骤B1a制备的蛋白酶抑制剂的B-PER TM试剂中，上下移液直至细胞悬浮液均匀。
4. 将再悬浮液转移到新鲜的1.5ml Eppendorf管中，并使用轨道摇动平台以100rpm在冰中轻轻摇动10分钟。
5. 通过在4℃以5000gxg离心10分钟使透化的蓝细菌细胞团粒化。丢弃上清液。*
*注意：重新悬浮是慢慢地上下移动五到八次。取决于手头的蓝藻种类，上清液中可能会出现淡黄色，这不是一个问题。与Synechococcus 7002细胞相比，Synechocystis 6803中的黄色更明显
1. 在含有蛋白酶抑制剂的500μlTris-HCl缓冲液（在步骤B1b中制备）中重悬含透化的蓝细菌细胞的沉淀。立即使用这个resuspension进行酶分析或储存在-20°C以备后用。参见图2，可以看出，与未处理的细胞相比，处理过的细胞的外观如何。
  
  图2.处理和未处理的蓝细菌细胞
叶绿素a浓度的测定
对程序A中制备的每个生物学重复进行以下步骤。
1. 简单地颠倒步骤B6中制备的透化的蓝细菌细胞，并在1.5-ml螺帽微量离心管中转移100μl。
  注意：渗透的细胞会很快沉淀，因此在取出指定体积之前将管反转一次或两次是很重要的。
2. 加入900μl96％（v / v）乙醇并盖上盖子。
3. 在90°C孵育5分钟，在700转/分钟的混合器中使用混匀器。
4. 在冰上冷却2分钟。
  注：冷却很重要，因为微管变得太热而无法处理。
5. 在冷藏台式离心机中，在10000℃下旋转细胞碎片达10分钟。
6. 将上清转移到1厘米的光路比色皿。
7. 用分光光度计测量664nm（664nm）和648nm（648nm）处的吸光度。
  注意：通常在离心步骤后5分钟内进行测量。
8. 计算叶绿素a浓度如下：叶绿素a（μg/ ml）=（13.36×664 / em） - 5.19×A 648）×10（Lichtenthaler和Buschmann，2001），其中包括倍增因子10以说明稀释效应。
酶活性的测定
注：每个条件有3个生物学重复（参见程序A中的注释a）;因此每个条件使用9个井（步骤D1a，D1c，D2a）。
1. Rubisco活性测定
  1. 将50μl在B6中制备的透化细胞转移至96孔板中的孔中。对每个生物复制品执行此操作。
    注意：渗透的细胞会很快沉淀，因此在取出指定体积之前将管反转一次或两次是很重要的。
  2. 将148μl缓冲液A（参见配方）和2μl1M NaHCO3分别加入含有透化细胞的每个孔中，并通过上下吸取轻轻混合。在冰上孵育10分钟以通过活性位点的完全氨甲酰化活化Rubisco。
  3. 加入10μl步骤D1a中制备的预温育的透化细胞制剂到新鲜的96孔板中的孔中。准备三个技术重复每个生物复制。
  4. 加入240μl的Rubisco测定缓冲液（见食谱）到每个技术的重复，轻轻吹动上下三次混合。
  5. 使用酶标仪在30°C监测340 nm波长的NADH氧化速率30 min。
2. G6PDH活性测定
  1. 将10μl在B6中制备的透化细胞转移到96孔板中的孔中。准备三个技术重复。
  2. 每个技术重复添加200μLG6PDH检测缓冲液（见食谱）。
    轻轻地上下移液3次
  3. 使用读板仪在30°C加入测定缓冲液30分钟后立即监测波长为340nm处的NADPH形成速率。

数据分析

计算Rubisco和G6PDH的活动如下：

通过使用SoftMax Pro软件，根据线性初始速率周期从每个曲线中获得一个斜率。对每个技术复制执行此操作。
使用斜率和NADH / NADPH在340 nm处的吸光系数为6.22 Abs mM -1 -1 cm -1计算酶活性。
通过叶绿素浓度使酶活性正常化。
注意：可以使用蛋白质浓度和干细胞重量代替叶绿素浓度来使酶活性正常化。通常，我们使用Micro BCA蛋白质测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific）测定蛋白质浓度。为了确定干细胞重量，我们使用前面描述的方案（De Porcellinis等，2017）。
计算技术重复的平均值。这代表生物重复的酶活性。
计算三个生物学重复之间的平均活性和标准偏差。学生的 t - 测试或单向ANOVA可用于评估条件之间差异的统计显着性。

笔记

当使用B-PER透化程序时，比较在相同条件下生长的细胞的独立实验中的酶活性是可再现的。
为获得高重复性，精确称量用于酶活性测定的商业酶的正确量是重要的。当将少量底物和其他试剂吸取到酶分析中时，同样的原则适用。

食谱

不含乙二胺四乙酸（EDTA）的c omplete TM蛋白酶抑制剂混合物
为了制备25x储备溶液，将一片片剂溶解于2ml灭菌的ddH 2 O中并储存于-20℃。
缓冲区A
15 mM MgCl 2 2/2 1 mM EDTA
50mM Tris-HCl，pH8.0
一个Rubisco检测缓冲液
50mM Tris-HCl，pH8.0
15 mM MgCl 2 2/2 1 mM EDTA
5毫米磷酸肌酸
10 mM NaCl
0.15 mM NADH
0.25 mM核酮糖-1,5-二磷酸盐
10 U甘油醛-3-磷酸脱氢酶
10 U 3-磷酸甘油磷酸激酶
2.5U肌酸磷酸激酶（Stitt和Schulze，1994）
G6PDH分析缓冲液
50mM三（羟甲基）氨基乙烷马来酸盐，pH7.8
10mM MgCl 2•/ 2 1 mM NADP +
10mM葡萄糖-6-磷酸盐（Schaeffer和Stanier，1978）

致谢

导致这些结果的研究得到了丹麦创新基金（Grant'Plant Power'，编号12-131834; Grant'21世纪生物质能'，编号001-2011-4），北欧能源研究（Grant “AquaFEED”第24号），欧盟第七框架计划FP7-ENERGY-2010-1，REA拨款协议号256808（Grant'DirectFuel'），人居计划（Marie Curie Actions）FP7 / 2007-2013根据REA拨款协议第317184号（Grant'PHOTO.COMM'）。该协议是从我们以前的工作（拉斯穆森等人，2016年）改编的。没有利益冲突。

参考

De Porcellinis，A.，Frigaard，N.U.和Sakuragi，Y。（2017）。蓝藻中糖原含量的测定
Hoiczyk，E.和Hansel，A。（2000）。蓝细菌细胞壁：来自不寻常的原核生物的信息 J Bacteriol < / em> 182（5）：1191-1199。
Lichtenthaler，H.K。和Buschmann，C。（2001）。叶绿素和类胡萝卜素：通过UV-VIS测量和表征。在：食品分析化学最新方案F4.3.1-F4。 John Wiley and Sons 。
Rasmussen，R.E.，Erstad，S.M.，Ramos-Martinez，E.M。，Fimognari，L.，De Porcellinis，A.J。和Sakuragi，Y。（2016）。蓝藻细菌体内酶活性测定的简单高效透析方案 >微生物细胞事实 15（1）：186.
Schaeffer，F。和Stanier，R.Y。（1978）。鱼腥藻属的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶动力学和分子性质 Arch Microbiol 116（1）：9-19。
Stanier，R.Y.，Kunisawa，R.，Mandel，M.和Cohen-Bazire，G.（1971）。单细胞蓝藻的净化和性质（订购Chroococcales）。 Bacteriol Rev 35（2）：171-205。
Stevens，S.E.Jr.，Patterson，C.O.P.和Myers，J。（1973）。蓝藻产生过氧化氢：一项调查。
Stitt，M。和Schulze，D。（1994）。 Rubisco是否控制着光合作用和植物生长的速度？分子生态生理学的一个练习。“植物细胞环境”17：465-487。