材料和试剂

质粒pDR274（Addgene，目录号：42250）
pBaitD-gap43-linker-EGFP（RIKEN DNA BANK，目录号：RDB15409）
Ampliscribe T7-Flash转录试剂盒（Epicentre，目录号：ASF3257）
RNeasy Plus迷你试剂盒（QIAGEN，产品目录号：74134）
PCR-Kit的; KOD-Plus-Neo（TOYOBO，货号：KOD-401）
氢氧化钠（NaOH）（NACALAI TESQUE，目录号：31511-05）
乙二胺四乙酸（EDTA）（NACALAI TESQUE，目录号：14347-21）
Tris-HCl（pH8.0）（NACALAI TESQUE，目录号：35435-11）
碱性裂解缓冲液（见食谱）
中和缓冲液（见食谱）

设备

镊子（DUMONT，型号：91-3869或等价物）
PCR热循环仪（NIPPON Genetics，目录号：TC-96GHbC）
孵化器（NK系统，目录号：LH-60FL3-DT）
荧光显微镜（徕卡，目录号：徕卡MZ8）

程序

使用gRNA评分算法（CRISPRscan; Moreno-Mateos等人，2015）搜索gRNA的靶序列，并选择在青aka基因组中具有较少脱靶位点的序列。
从选择的供应商获得选定的gRNA寡核苷酸。
退火寡核苷酸并将退火的片段插入到gRNA表达质粒pDR274（Addgene Plasmid＃42250）中。
使用Ampliscribe T7-Flash转录试剂盒从DraI I消化的质粒转录，并用RNeasy Plus Mini试剂盒纯化转录物以消除不用DNase处理的模板DNA。
使用具有限制酶位点的区域特异性引物PCR扩增基因组靶位点的上游和下游区域（同源臂：500bp），其有助于插入到在第6步。
将含有接头，报道基因和polyA信号的同源臂，插入片段连接到包含BaitD序列的骨架质粒中，有助于在青aka中高效诱导基因敲入事件（图1A）。
注意：含有BaitD的供体质粒可以从RIKEN DNA BANK（pBaitD-gap43-linker-EGFP＃15409）获得。供体质粒的序列显示为：补充文件1。

图1.基因敲入实验的示意图A.供体质粒的示意图设计。使用具有限制酶位点的区域特异性引物分别扩增左（蓝色（A））和右（绿色（A））同源臂（500 Xho I / Bam HI或 Eco RI / I）。接头序列稳定以表达报告基因（ GFP 或 RFP ）作为与目标基因产物的融合蛋白。诱饵是供体质粒线性化而被切割的序列，并且增强了青gene中的基因敲入事件。雷霆标记通过Cas9和gRNA1或gRNA2分别显示基因组和供体质粒上的切割位点。 B.显示插入基因精确整合到基因组靶位点的示意图。报告基因（ GFP 或 RFP ）被整合到外显子和框内。蓝色和绿色三角形显示基因组靶位点和供体质粒片段之间的连接点。标记为（1）/（2）或（3）/（4）的引物对可用于扩增上游或下游连接区。为了确认与基因组靶位点的精确整合，在接合处外侧设计了引物（1）和（4）。
注入以下解决方案到胚胎; 100ng /μl的Cas9 RNA，50ng /μl的用于切割基因组靶位点和供体质粒的sgRNA以及2.5ng /μl的每种供体质粒。
注意：有关显微注射协议的详细信息，请参阅“ Medaka-microinjection ”。
提高表达每个记者基因的胚胎成人约2个月。
与野生型同行交配。（第一次交配）
根据以下方案从表达每个报道基因的所得F1胚胎提取基因组DNA：
1. 把胚胎放入25μl的碱裂解缓冲液（见食谱）。
2. 用镊子打破蛋壳后，在95°C孵育15分钟。
3. 用25μl中和缓冲液中和（见食谱）。
注意：DNA提取仅对于F1代是必需的，因为需要通过序列分析来研究插入基因是否正确整合到基因组靶位点中。
使用F1基因组PCR扩增宿主基因组上目标位点的连接区和导入的基因（图1B）。注意：PCR条件按照KOD-Plus-Neo（Toyobo）的方案进行。
执行所得PCR扩增子的序列分析，以确认精确整合到基因组目标位点。
在确定F0的创始人与所需的突变之后，再次与野生型同行交配。（第二次交配）
注：第一次交配是为了在生殖细胞中鉴定携带插入基因的F0创始者，而第二次交配是为了在F1代中建立基因敲入株。
收集表达每个报道基因的F1胚胎，并饲养长度＆gt; 1厘米。
切断每条F1鱼的尾鳍，进行如上所述的基因组提取和序列分析
在通过序列分析确认每个F1鱼的基因组目标位点的精确整合之后，将携带不同颜色记者基因的F1鱼彼此交配。
观察所得F2胚胎的荧光颜色，以指定将插入基因整合到目标位点上的个体。
注：产生的F2胚胎通过荧光颜色进行活的基因分型：无荧光的野生型，与一种荧光整合的单等位基因突变体以及与两种荧光整合的双等位基因突变体。

食谱

碱性裂解液
25mM NaOH
0.2mM EDTA
中和缓冲液
40mM Tris-HCl（pH8.0）

致谢

这个协议是从我们以前的作品（Murakami等人，2017年）改编的。这项工作部分得到了科学研究资助（A）15H02540（MK）和JSPS研究员13J01682（SA）的资助。资助者在设计研究和收集，分析或解释数据或撰写稿件方面没有任何作用。作者声明与本手稿没有利益冲突或利益冲突。

参考

Fujimori，K.E.，Kawasaki，T.，Deguchi，T。和Yuba，S。（2008）。青蒿中生长相关蛋白43基因神经系统特异性启动子的特征（ Oryzias latipes ）。 Brain Res 1245：1-15。
Moreno-Mateos，M.A.，Vejnar，C.E.，Beaudoin，J.D.，Fernandez，J.P.，Mis，E.K。，Khokha，M.K。和Giraldez，A.J。（2015）。 CRISPRscan：为CRISPR-Cas9设计针对体内的高效sgRNAs 。 Nat Methods 12（10）：982-988。
Murakami，Y.，Ansai，S.，Yonemura，A.和Kinoshita，M.（2017）。一种高效的青aka同源依赖靶向基因整合系统（ Oryzias latipes ）。 Zoological Lett 3：10。