材料和试剂

来自Douglas Stephens Plastics，Paterson 640 NJ的透明塑料熟食容器（例如，长16.5cm，宽13cm，深5cm的'B16-双热狗蛤壳壳'）的标签室< br />
盆栽混合物（Sun Gro园艺，目录号：Fafard 3B Mix;或类似物）
10毫升注射器（没有连接针头）（Luer-Lok Tip，BD，目录号：309604）
道康宁高真空润滑脂
塑造黏土（美国艺术粘土）
苏格兰威士忌可拆卸安装油灰
5毫升塑料注射器筒和柱塞（Luer-Lok Tip，BD，目录号：309646）
注射针，1.5-2.0英寸，18号（Monoject Needle，Covidien，目录号：1188818112）
由湿纸巾内衬的上述透明塑料熟食容器产生的高湿度室
培养皿（100×25毫米）（Fisher Scientific，目录号：FB0875711）
24孔培养板（Greiner Bio One International，目录号：662160）
微量离心管（Fisher Scientific，目录号：05-408-138）
微量离心管，带O形环的螺旋盖（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：3464）
20ml闪烁瓶（Fisher Scientific，目录号：12383317）
双刃刀片（PERSONNA品牌）（电子显微镜科学，目录号：72000）
植物材料（例如，拟南芥Col-0，对照和实验材料）; ＆GT;
每个处理12个健康植物，每个标记室有3个WT和3个实验植物
碳酸氢钠[14 C] NaHCO 3（MP Biomedicals;目录号：0117441H; 40-60mCi / mmol; 2mCi / ml; 5mCi; 185MBq） br />
乳酸（85％）（Fisher Scientific，目录号：A162-500）
将碱石灰（LI-COR，目录号：9964-090）松散地填充以填充柱（例如Bio-Rad Econo-Column，1.5×20cm; Bio-Rad Laboratories，目录号：7371522）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）
用于pH值调整的氢氧化钾（KOH）（Fisher Scientific）
乙醇绝对（Pharmco-AAPER，目录号：111000200）
商业漂白剂（次氯酸钠，NaClO）
Ecolume闪烁液（MP Biomedicals，目录号：0188247004）
5毫米EDTA溶液（见食谱）

设备

控制和实验工厂的环境增长室
个人安全设备：实验室外套，丁腈手套（或类似的）和护目镜
适用于光合标记的灯，如400瓦金属卤化物灯（SYLVANIA 64490 - 400瓦 - BT37 - 金属卤化物灯）
通风橱适当支撑金属卤化物灯（图1）
测光表（LI-COR 1400）
软木钻（科学公司，目录号：NC-11269）
用于空气循环的超薄型微型鼓风机（可选; Exton PA，Pelonis Technologies，产品目录号：RFB3004;由四个1.5伏D型电池依次供电，以提供6伏电压）
带入口和出口的小型空气泵（例如，Airpo，Barcodable，产品目录号：UPC 045635496699）
清除塑料管（内径4和6毫米）
剪刀（Fisher Scientific，目录号：08-951-20）
镊子（Fisher Scientific，目录号：22-327379）
平衡可读性至少1毫克（梅特勒 - 托利多，型号：AE100）
移液器（Bioexpress，GeneMate，P20-P1000）
微量离心机
旋转平台摇床（轨道摇床变量，BioExpress，GeneMate，目录号：S-3200-LS）
盖革计数器（Ludlum测量，模型：模型3）
闪烁计数器（贝克曼计数器，型号：LS 6000IC）

程序

准备一个适合于[14C] CO_2光同化的工作区
1. 与任何放射性核素合作需要得到适当的机构办公室的特别考虑和批准。清关可能需要很长时间（几个月或更长时间），申请流程应该尽早开始，或者与已经批准的团体建立合作关系。
2. [14C] NaHCO 3储备将释放气态[14 C] CO 2 2。为了尽量减少这一点，商业库存缓冲到pH 9.5。库存应储存在4°C而不是-20°C：我们建议将样品分装到带有O型圈的1.5 ml螺旋盖微量离心管中。应按实验所在机构的要求记录库存的收货和使用情况。
3. 在这个过程中，通过酸化[14 C] NaHCO 3 3产生[14 C] CO 2气体，。建议在专用通风橱中建立一个工作区域（对[14C] CO 2 使用适当的陷阱;见下文）。
4. 在通风柜内，400瓦金属卤化物灯悬挂在工作区域上方60至90厘米处。
  在我们的通风橱里，我们用2×4木材制作了一个简单的框架，用来悬挂灯（图1）
5. 灯与工作表面之间的距离将影响植物所暴露的光子通量密度。我们的灯在通风橱台面上方90厘米，我们在15厘米的平台上工作，所以植物离灯泡75厘米。在这个距离，我们可以暴露六个指示的蛤壳式容器与130μmolphotons m 2 sup-1 -1的相同的照明，如PAR（光合有效辐射）传感器。
  
  图1.表示安装在通风橱内的框架，并允许金属卤化物灯支撑在标签工作表面的上方。框架由标准2 x 4木材（橙色）制成，和400瓦的金属卤化物灯（红/黄）由金属杆（黑色）支撑。
发芽和种植植物的策略
1. 在透明的蛤壳式熟食容器中的盆栽混合物中发芽种子。使用一个6毫米的软木塞钻机在翻盖的熟食容器的底部设置排水孔进行曝气和排水。用盆栽混合物填充蛤壳式容器的下半部分，深度为3.5厘米，然后浇灌盆栽混合物。通过在盆栽混合物上生长的标准程序添加种子并发芽（Dasgupta等人，2014; Khadilkar等人，2016）。
  注意：
  1. 每个蛤壳式熟食容器将是一个独立的[14C] CO 2标签室。因此，控制和实验工厂应该在同一个房间里一起生长。在我们使用的蛤壳式容器中，可以种植九种植物而不会拥挤21-28天。我们通常在一个容器中随机设计生长WT对照和两个实验谱系，并有六个复制容器。
  2. 下胚轴将被切割并浸没在EDTA溶液中以收集渗出物。在黑暗的地方，如在一个不透光的柜子，抽屉或盒子里，种子发芽4至5天将促进下胚轴伸长，使其更容易处理。
2. 在12μm光照（22℃）/ 12小时黑暗（20℃）昼夜循环中以130μmol光子m 2 / s -1或其它适合具体实验的条件。保持室的盖子打开，并保持灌溉混合物生长的植物适当的浇水和肥料水平。种植植物21-28天，以产生3至4厘米直径的玫瑰花结。
  注：从营养生长到生殖生长的转变影响源/汇关系。我们计划我们的实验，使所有的植物在标签和渗出过程中只有营养。
制备[14 C] CO 2 2-光合标记
1. 在植物标记的那天拍摄植物。贴标前一个小时左右打开通风橱内的400W金属卤化物灯，达到稳定的强度。在金属卤化物灯下使植物适应大约一个小时，然后打开贴标签盖。
  注意：
  1. 通过昼夜循环，光合作用，碳分配到不同的代谢库，以及长途运输到宿主器官都是波动的。为了保持一致性，我们通常在光照期间标记6小时。
  2. 虽然六个蛤壳式容器可以安装在灯光下，并获得相同的光照强度，但在一天内处理这些植物数量是不切实际的（见表1的时间表）。两个人一起工作，我们一天处理三个蛤壳式容器，第二天另外处理三个。最好在两天的时间内分散实验，并在昼夜周期的同一阶段进行标记，而不是在一天中明显不同的时间处理第一个蛤壳式容器和最后一个蛤壳式容器。
  表1.组织标签和处理三个房间的样本时间表（框架）
2. 准备标签的商会。在每个蛤壳式容器的盖子上做两个孔：一个在正面的一个小孔注入[14C] CO 2 ，另一个稍微大一些在标记后去除剩余的[ 14 C] CO 2 （参见流程图，图2A）。用本生灯加热的回形针末端效果很好。为了改善标签室的密封性，用真空润滑脂填充10毫升注射器（不带针头），并在封盖的内边缘周围涂上一个小珠，但是在贴标签之前不要关闭和密封封盖。
  使用一个塑料粘土的小球覆盖注入和排气孔
  
  图2.光合标记拟南芥属植物的图示流程图，其中[14 C] CO 2 2和收集和定量的 2 将14 C的渗出物分散到EDTA溶液中。A.将植物拟南芥植物在透明塑料熟食容器中培养3-4周，所述塑料熟食容器包含盆栽混合物并在底部具有用于排水和曝气的孔顶部有两个孔，用于注入和排出[14C] CO 2（箭头形的圆形蓝色注射和红色的排气）。使金属卤化物灯下的通风橱中的植物适应大约一个小时。保持盖子打开直到贴标签为止，然后在盖子周围涂上一层真空润滑脂进行密封;在注入孔和排气孔上放一小块建模粘土。 B.准备用于注射[14 C] CO 2 2的注射器筒。一桶切到〜3厘米比一个完好的桶更容易工作。将2.5μl的[14 C] NaHCO 3 3置于针（用黄色箭头表示）附近的针筒中，并将15μl乳酸置于〜1cm处（用灰色箭头）。 C.轻轻地将活塞插入桶内而不干扰[14C] NaHCO 3和乳酸的单独滴。 D.将针穿过注射孔并通过混合[14 C] NaHCO 3 3而形成[14 C] CO 2 2，用乳酸;泵动柱塞2-3次以彻底混合并将标记的气体推入腔室。 E.让光合作用在金属卤化物灯下进行20分钟'脉冲'。 F.使用与真空泵连接的聚乙烯管和含有碱石的柱，通过排气孔除去剩余的未同化的[14 C] CO 2 5分钟。 G.打开贴标签的盖子，让光合作用继续进行35分钟的“追逐”。 H.轻轻切割土壤表面下的茎。 I.清除根面的土壤颗粒，记录鲜重。 J.在EDTA溶液下通过下胚轴切断以防止筛网元件密封。 K.将芽转移到含有EDTA溶液的24孔培养板中，使溶液中仅有〜2mm的下胚轴。将平板置于湿度室中，然后在黑暗中放置10分钟。同样采用EDTA溶液收集随后在24孔培养板中渗出的1s和2h。 L.收集分泌物后，将平板放置在冰上以使酶活性最小化，直到它们能被方便地进一步处理（图像显示在冰床上）。将韧皮部渗出液转移到闪烁瓶中，并添加闪烁液（M）进行闪烁计数。
  标记的花环也应计算在内。
3. 创建一个时间表（表1）来组织三个复制容器的处理。
4. 在光源下方放置三个重复的容器并使其适应环境，关闭第一个室的盖子，以确保密封。为了产生用于标记的[14 C] CO 2 2，移取2.5μl的[14 C] NaHCO 3（ 2μCi/μl）在注射器针筒的注射器针接头附近的液滴中切割至〜3cm（图2B）。将15μl85％的乳酸液滴放入桶中，注意保持该液滴与[14 C] NaHCO 3液滴分离。轻轻地将柱塞插入桶内（图2C）。将针穿过蛤壳式容器的注入孔，并在其周围放置造型粘土（图2D和2E）以密封孔;确保排气孔也被覆盖。在这些步骤中保持[14 C] NaHCO 3和乳酸的液滴分离。轻轻推动柱塞，将乳酸与[14 C] NaHCO 3混合并释放[14 C] CO 2 2，进入腔室的空间。前后移动柱塞将[14C] CO 2气体泵入蛤壳式容器中;避免将液体注入腔内，因为乳酸会损害植物。
  拆下针头并用注塑粘土盖住注射孔。
  C 2 在小型电子设备（例如，Pelonis Technologies目录号RFB3004）中通常使用的小型鼓风机可以被定向在贴标签腔室内以将空气吹过工厂。我们通常使用Scotch Removable Mounting Putty将鼓风机固定在燃烧室的顶部或侧面，通过用于密封燃烧室顶部和底部半部分的真空润滑脂形成电线。电池由D-cell电池提供。
5. 允许植物在[14 C] CO 2存在下进行光合作用20分钟。这是“脉冲”阶段（图2E）。
6. 第一个房间的植物正在贴上标签，准备第二个房间，如表1所示，然后标记第三个房间，等等。
7. 注入14C] CO 2 20分钟后，使用较大的孔通过碱石灰排出反应室并捕获未同化的[14 C] ] CO 2（图2F）。一个装满苏打石灰的管子连接着一个气泵，工作良好（图3）。在通过碱石灰通气5分钟后，打开室盖（图2G），使光合作用继续进行35分钟。这提供了40分钟的“追逐”时间。
  注意：为确保碱石灰有效捕获未被同化的CO 2，应在使用之间保持新鲜和良好的密封性。旧苏打石灰应作为14 C标记的干燥废物丢弃。
  
  图3.用于去除和捕获未同化的[14C] CO 2的排气系统。一列如Bio-Rad色谱柱，充满苏打石灰以捕获残留的[14 C] CO 2 2。柱子的一端有管子（内径4mm）插入贴标签室（红色箭头），以排出剩余的[14C] CO 2。另一端连接到小型气泵的进气口，出气口排入通风柜的排气管。苏打石灰塔的两端都装有活塞，以便在不使用塔时，将碱石灰暴露于环境CO 2下降到最低程度。
收集韧皮部分泌物
1. 在开始标记之前，为每个蛤壳标记室准备三个24孔培养板。这些将被用于初始洗涤步骤，分别是渗出的第一个h和渗出的第二个h。用500μl5mM EDTA溶液填充9个很宽的孔，并放置直到需要。准备高湿室：如上所述用真空润滑脂珠制备蛤壳式容器（每个标签室一个）;用湿纸巾将容器的下半部分排成一列。在渗出过程中，将24孔培养板置于这些高湿度的室中，室将放置在黑暗中以刺激气孔关闭并限制蒸腾作用。
2. 在T = 60分钟时，使用小而锋利的剪刀剪下根部最上部的下胚轴。去除附着在植物上的任何土壤，并记录莲座鲜重（图2H和2I）。
  注意：这个重量将包括在下一个步骤（D3）中被移除的一小部分根部，但是我们认为这个小部分是微不足道的，重要的是快速地进行步骤D3而不重新组织重量。 em>
3. 将茎的切割末端浸入含有5mM EDTA的培养皿中。保持茎淹没，使用一半的双刃剃刀刀片，纵向劈开一半，以干净切片从第一次切割（图2I和2J）〜5毫米的下胚轴茎杆。
  注：双刃刀片比单刃刀片锋利。安全地使用它们时，将刀片沿着中心纵向折叠，同时保持在保护包装中，并将其对齐，以提供安全的单刃刀片。
4. 将每个花环立即转移到第一个准备好的含有500μl5mM EDTA溶液的24-孔培养板中，以使〜2mm的茎切下。
  最小化EDTA暴露于其余植物组织（图2K）。
5. 一旦处理了所有九个植物，将24孔培养板置于蛤壳式湿度室中并关闭该室以维持接近100％的湿度（图2K）。将湿度室放在完全黑暗的地方，如抽屉或盒子，以促进气孔关闭。
  注意：
  1. 步骤D1至D5应该小心而有效地进行。表1允许〜10分钟处理每个标记室中的9个植物，并且在EDTA溶液中处理〜10分钟。这个初步的洗涤步骤旨在去除切割和损坏的表面释放的酶。
  2. 将植物置于高湿度和黑暗环境中直至进一步处理。在整个洗涤步骤和随后的收集步骤中，植物应该处于高湿度和黑暗环境中，除非它们正在积极地进行处理。
6. 将每个玫瑰花结转移到第二个24孔培养板上，在EDTA溶液中仅浸渍〜2mm的茎杆。将此培养皿置于湿度室中，密封盖子并在黑暗中保存1小时。如果要计数来自第一个板（即EDTA洗涤溶液）的渗出物，将板储存在冰上以使潜在的酶活性最小化，直到可以方便地进行闪烁计数处理（图2L）。将溶液转移到微量离心管中并储存在冷冻箱中以进行长期储存。
7. 60分钟渗出之后，将玫瑰花结转移到第三个24孔培养板上，仅在EDTA溶液中浸没约2mm的茎梗。将第三块板放在湿度箱中，在黑暗中储存60分钟。将第二个板（即第一个小时的渗出物）置于冰上以使潜在的酶活性最小化，直到可以方便地进行闪烁计数处理（图2L）。将溶液转移到微量离心管中并储存在冷冻箱中以进行长期储存。
8. 60分钟后，取出玫瑰花结，在冰上冷却第三块板（即第二小时的渗出液），以使潜在的酶活性最小化，直到可以方便地进行闪烁计数处理（图2L），或者将溶液转移到微量离心管中，并储存在冰箱中以进行长期储存。
闪烁计数分析韧皮部分泌物
1. 将400μl的每种EDTA溶液转移到闪烁小瓶中（图2M）并加入5ml闪烁液用于含水样品。摇动小瓶以彻底混合，形成单相溶液。用闪烁计数器和适用于14C的程序记录每分钟计数（cpm）或每分钟崩解（dpm）。在500μl渗出物中计算每个玫瑰花丛质量中的14 C：cpm或dpm（鲜重）-1 h -1。应该通过闪烁计数来分析第一和第二小时的分泌物，并且应该给出合理的一致计数。剩余的EDTA溶液应该被收集并作为14 C液体废物处理。
2. 为了评估标记的光合同化物在芽中的剩余数量，将玫瑰花结浸入1ml 80％的乙醇中，在振荡器上轻轻摇动约1小时以提取色素和代谢物（较大的玫瑰花结可能需要更大的体积）。加入500μL的商业漂白剂，搅拌〜1小时，以消灭颜料。加入足够的闪烁液并充分混合，得到清晰的单相溶液; 5-10体积的闪烁液到1体积的乙醇/漂白剂溶液应该足够了。
3. （可选）要通过HPLC或酶分析来测量单个代谢物，向分泌液中加入500μl氯仿，混合并离心分离各相。回收水相到极性代谢物的新鲜微量离心管中。保留氯仿相，如果需要分析非极性代谢物。
4. 如果需要的话，可将分泌物储存在-20℃下进一步分析，同时记住渗出物用14 C同位素标记。

数据分析

数据分析的实验设计：
每个室构成一个独立的标记实验。从每个平板中的实验植物获得的值应该被标准化为相同室中WT对照的百分比值。然后将来自分离室的标准化值作为独立的重复进行组合。这消除了标记效率的室间变化，以提供对照和实验植物之间在光同化，分布和运输方面的差异的更精确表示（Khadilkar et al。，2016）。

食谱

EDTA溶液（0.5M储备500ml）（FW 292.24）
将73.06g EDTA溶于300ml ddH 2 O中用5N KOH调节pH至8.0。使最终卷500毫升
液体循环高压灭菌15分钟
在室温下储存
对于工作浓度，稀释100倍准备5毫米所需的体积，并调整到pH 6.0

致谢

该协议基于（Dasgupta等人，2014; Khadilkar等人，2016年）中公布的方法。在B.G.上进行韧皮部装载和长途运输。 Ayre的实验室由美国国家科学基金会0344088,0922546,1121819和1558012支持。作者报告没有利益冲突或利益冲突。

参考

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