材料和试剂

物料
1. 30毫升ultraclear ultracentrifuge管（贝克曼库尔特，目录号码：344058）
2. 10ml圆底聚丙烯管（Corning，Falcon，目录号：352059）
3. 40微米尼龙网格细胞过滤器（Biologix，目录号：15-1040）
4. 50ml锥形聚丙烯管（BioExpress，目录号：C-3394-4）
5. 15厘米玻璃巴斯德吸管（Fisher Scientific，目录号：13-678-20A）
6. 20号针（Fisher Scientific，目录号：14-826-5C）
  制造商：BD，目录号：305176。
7. 10毫升注射器（BD，目录号：309604）
8. 1.7 ml低粘性疏水管（BioExpress，GeneMate，目录号：C-3302-1）
9. 5毫升锥形聚苯乙烯管与细胞过滤器盖（康宁，目录号：352235）
10. 0.45μm聚丙烯注射器过滤器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：F2500-9）
试剂

乙醇
4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Sigma-Aldrich，目录号：D9542）
蛋白A-缀合的磁珠（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：10001D）
抗TMEM38A抗体（Merck，目录号：06-1005）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Fisher Scientific，目录号：BP120）
氢氧化钠（NaOH）（Fisher Scientific，目录号：S318）
乙二醇 - 双（β-氨基乙基醚）N，N，N'，N'-四乙酸（EGTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）
蔗糖（Fisher Scientific，目录号：BP220）＆nbsp;
HEPES（Fisher Scientific，目录号：BP310）
氯化钾（KCl）（Fisher Scientific，目录号：P217）
氯化镁六水合物（MgCl 2•6H 2 O）（Fisher Scientific，目录号：M33）
亚精胺（Sigma-Aldrich，目录号：85558）
二硫苏糖醇（DTT）（美国生物，目录号：D8070）
完全小型蛋白酶抑制剂（Roche Diagnostic，目录号：11836153001）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）
精胺四盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：S2876）
1x磷酸盐缓冲盐水（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：21600069）
100 mM EDTA（见食谱）
100 mM EGTA（见食谱）
2.1 M蔗糖溶液（见食谱）
2.8 M蔗糖溶液（见食谱）
匀浆缓冲液（见食谱）
1％BSA均质缓冲液（见食谱）
重悬缓冲液（见食谱）
1％BSA重悬缓冲液（见食谱）

设备

解剖设备
1. 针（卡罗莱纳州生物供应公司，目录号：629122）
2. 4.5寸尖头解剖剪（Fisher Scientific，目录号：08-940）
3. 止血剂（GF HEALTH PRODUCTS，目录号：2675）
15毫升Dounce均化器与聚四氟乙烯锯齿柱塞（科尔 - 帕默仪器，目录号码：44468 - 10和44468 - 16）
紫外灯（可选）（Spectroline，目录号：ENF-240C）
离心机（Eppendorf，型号：5702）
微量离心机（国际设备公司，型号：S139068）
注：此产品已停产。
超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima TM LE-80K，LLE7）
SW 32钛回转斗式转子（Beckman Coulter，型号：SW 32 Ti，目录号：369650）
UltraRocker摇摆平台（Bio-Rad Laboratories，目录号：1660709EDU）
磁铁（可选）（Thermo Fisher Scientific，目录号：12320D）
圆形的微小支架（Fisher Scientific，目录号：21-401-5）

程序

注意：所有的溶液都应该冷冻到4°C，所有的步骤都要在4°C下进行，以降低酶的活性，保持样品的完整性。

准备2.8 M和2.1 M蔗糖溶液（见食谱）和缓冲液。
注意：如果将8ml的2.8M蔗糖溶液加入到30ml超速离心管的底部，然后将其冷却至4℃，则制备蔗糖梯度是最容易的。
用乙醇彻底清洗切碎设备。
解剖小鼠的腓肠肌和股直肌（图1和视频1和2），并在10 ml圆底管中放置4个肌肉。
注意：
1. 比目鱼肌在解剖过程中经常粘附在腓肠肌上。
  在进行腓肠肌处理之前，从腓肠肌取出比目鱼。
2. 股直肌是组成四头肌的四块肌肉之一。
图1.肌肉解剖 1.从鼠标躺在腹侧开始，使用止血钳将皮肤从脚踝收回到臀部。 2.移除膝盖后面的脂肪垫。 3.将剪刀插入跟腱后面。 4.用剪刀将腓肠肌与下面的组织分开。 5.切开跟腱和腓肠肌的头部。如果比目鱼仍附着在腓肠肌上，请将其取出。 6.将鼠标转过来，使其仰卧。 7.取下臀部的脂肪垫。用平行于股骨的剪刀剪断将股直肌连接至髋臼（膝盖）的肌腱并纵向延伸至髋部。最后，用垂直于股骨的剪刀剪断将肌肉连接到髂骨的肌腱并收集股直肌。

视频1

视频2
用剪刀剁碎肌肉。
加入5ml冷冻均质缓冲液（参见食谱）1-2个肌肉或10ml冷却的均化缓冲液，使3-4个肌肉达到切碎的肌肉。
用Dounce匀浆器在冰上匀浆约50次（直到所有的大块肌肉都从匀浆器的底部被压到柱塞的顶部）（图2）。
注意：
1. 警告：活塞与均质缓冲器表面之间可能会形成真空。如果柱塞快速撞击缓冲液，可能会破碎均质器。
2. 如果你从4个以上的肌肉匀浆匀浆，分别匀浆，然后在步骤7之前将匀浆混合。
3. 老年人或再生肌肉样本可能需要更长的时间才能均匀。
4. 均质器和解剖器械应该用乙醇和水清洗。
图2.预超速离心制备1.使用剪刀收集管中收集的肌肉。完整的肌肉显示在左侧，右侧显示肌肉。 2.将绞碎的肌肉悬浮在10毫升均化缓冲液中。 3.使用Dounce匀浆器匀化肌肉。 4.将匀浆通过40μm过滤器，通入50ml锥形管中。不完全破坏的组织和大碎片将保留在过滤器。 5.将滤液离心以获得粗制的核颗粒（箭头）。 DAPI在UV光下清楚地标记核小球。警告：杵和匀浆之间可能形成均质真空。如果杵被吸入均化器，它可以用足够的力量击碎均化器。
用1-2毫升匀浆缓冲液冲洗一个40微米的过滤器。通过这个过滤器的匀浆到50毫升圆锥形。
注意：不能通过过滤器的纤维材料可能会堵塞过滤器。

轻轻地刮过滤器，用一个圆形的微小支架来帮助滤液通过。
用5毫升匀浆缓冲液冲洗过滤器。
将滤液在4℃下1000×g离心10分钟以获得粗制的核颗粒。
在离心过程中，在30ml超速离心管中，将2.8ml 2.1M蔗糖溶液小心地置于2.8M蔗糖垫上。
离心完成后，弃去细胞质上清液，并在8毫升均质缓冲液中重悬粗核沉淀。小心地将重悬的裂解物铺在蔗糖梯度的顶部。
注意：
1. 如果在此步骤中将DAPI以1μg/ ml的终浓度添加到匀浆中，则可以显现蔗糖梯度中的细胞核的位置。
2. 可以保存细胞质部分用于随后的生化或蛋白质组分析。如果立即使用，细胞质部分应保存在冰上。为了长期储存，应将细胞质部分分装并储存在-80℃。
按重量平衡超速离心管。
在4°C下，将样品以186,712 G（SW 32 Ti Beckman摆动转子中的32,000 rpm）离心200分钟。
在离心过程中，通过在20℃下用20ml 1％BSA重悬缓冲液（参见食谱）在4℃下用标准实验室摇床低速摇动至少30分钟，涂布含有BSA的50ml锥形管。
注意：取下手套箱的顶部可以使管子在摇杆上滚动，甚至可以将多达6个试管的BSA涂层（图3）。

图3.加载超速离心管。在开始实验之前，应将2.8 M蔗糖分层放入超速离心管底部并冷冻。在肌肉匀浆的1,000×g离心步骤期间，在2.8M溶液上层冷却2.1M蔗糖溶液。完成肌匀浆的离心分离后，将粗核沉淀物在匀浆缓冲液中重新悬浮，并小心地在2.1M溶液上铺满。 DAPI标记裂解物中的细胞核。在超离心步骤期间涂布50毫升含有BSA的锥形管，通过允许管在摇杆上的盒子中滚动来简化。
超速离心完成后，将上层蔗糖梯度抽吸到2.1M和2.8M边界的厘米内。使用玻璃巴斯德吸管收集2.1 M / 2.8 M接口到BSA涂层的50 ml锥形管中（图4步骤1-4）。
注意：
1. 如果上覆层已被正确地移除，那么用来自另一界面的材料污染核碎片的危险很小。因此，在界面以上1厘米和1厘米处收集将增加核的产率而不危害该分数的纯度。
2. 如果已将DAPI添加到匀浆中，则可以用紫外光使梯度中的细胞核的位置可视化。在紫外光下的DAPI荧光可以用来确认收集了包含细胞核的整个界面（图4步骤4）。
3. 可以通过用20号针头和10ml注射器刺穿超速离心管的一侧来收集细胞核。但是，细胞核被剪切穿过针头，蔗糖的高粘度使得收集困难。类似地，由于2.8M蔗糖的高粘度，难以从梯度底部开始收集馏分。＆nbsp;
图4.卸载超速离心管1.确定含有核分数的2.8M和2.1M蔗糖溶液之间的界面（白色箭头）。通过DAPI荧光在紫外光下很容易识别。 2.将覆盖层吸入核分数以上一厘米（白色箭头）。 3.将核分数收集到BSA包被的50ml锥形管中。可以通过DAPI荧光观察到部分中的核。 4.收集细胞核组分后，细胞核的薄的灰色带将不再可见，在超速离心管或从剩余溶液表面收集的蔗糖中不能检测到DAPI荧光。 5.通过将BSA包被的50ml锥形管颠倒几次，将悬浮于悬浮缓冲液中的收集的细胞核分数1:10重新悬浮。 6.通过离心沉淀纯化的细胞核。无论是否使用DAPI标记，核颗粒都很容易看到。 7.取出上清液，并重悬在1.5毫升悬浮缓冲液沉淀。 8.离心沉淀细胞核。核可以重新悬浮成像或洗2次以上的生化和蛋白质组学分析。
稀释收集的界面在50毫升锥形管1:10用重悬缓冲液（见食谱）。
反转5-10次（图4步骤5）注意：所收集的接口比重悬缓冲区更密集。小心完全混合界面和重悬缓冲区。
在4℃下将稀释的界面在1,000ml xg的1000ml锥形管中离心10分钟（图4步骤6）。
弃去上清液，重新悬浮在1毫升悬浮缓冲液核颗粒，并转移到1.7毫升管。
注意：对于流式细胞术和显微镜检查，用1％BSA将细胞核悬浮在冷冻的重悬缓冲液中。
将重新悬浮的细胞核在4℃以800×g离心10分钟（图4步骤8）。＆nbsp;
丢弃上清液，并在适当的缓冲液中重新悬浮核沉淀（见图5A代表孤立核的代表性图像）。
注意：
1. 对于流式细胞术，用1％BSA重悬沉淀于500μl重悬缓冲液中，并在分析之前通过35μm细胞过滤器进入5ml聚苯乙烯管。＆lt; em>
2. 对于显微镜检查，用1％BSA重新悬浮于1-3ml重悬浮缓冲液中的核沉淀。
3. 对于蛋白质印迹或质谱法，用再悬浮缓冲液洗两次核沉淀以去除残余的BSA，然后重悬于合适的变性缓冲液中。＆lt; em>

可选替代方法
如果生化纯度不重要，可以通过亲和纯化更快地分离核。通过亲和纯化分离的核耗尽线粒体和细胞质标记，但保留大量的内质网标记。如果已知特定的核标记，亲和纯化可以很容易地应用于其他细胞类型（Deal和Henikoff，2011）。
注意：所有溶液应该冷冻到4°C，所有的步骤都要在4°C下进行。

通过在1.7ml微量离心管中用500μl匀浆缓冲液孵育5分钟，摇动1.5mg蛋白A缀合的磁珠。然后将试管置于磁力分离架上等待20秒，使试剂珠在试管侧积聚并吸取缓冲液。重复2次。
加入5微克抗TMEM38A抗体和200微升含有1％BSA的均化缓冲液。在4°C下低温摇动30分钟。
注意：必须使用磁珠而不是琼脂糖或琼脂糖珠，因为碎片会与琼脂糖或琼脂糖珠结合，但可以与磁珠堆积在放置磁体的管侧面的磁珠分离。
如上述步骤2-8所述处理样品。
离心得到粗制的核沉淀（在上述步骤8中描述）后，丢弃上清液并将沉淀重悬于1ml含有1％BSA的冷冻均质缓冲液中。
孵育磁珠与重新悬浮的细胞核从4肌肉在4°C的30分钟轻轻摇摆。
将包含珠子的试管置于磁力分离架上，等待20秒，使珠子积聚在试管的侧面。
吸入管底部的缓冲液和碎屑
用500μl含1％BSA的冷冻均质缓冲液清洗磁珠一次（见食谱）。
在下游应用中将珠子重悬在合适的缓冲液中（见图5B）注意：
1. 对于流式细胞术，用1％BSA将细胞核重新悬浮于500μl重悬缓冲液中，并在分析前通过35μm细胞过滤器进入5ml聚苯乙烯管中。
2. 对于显微镜检查，用1％BSA重悬悬浮缓冲液中的核。
3. 对于蛋白质印迹或质谱法，用PBS洗涤细胞核两次以去除残留的BSA，并重悬于适当的变性缓冲液中用于下游应用。＆lt; / em>
图5.纯化的肌细胞核A.通过2.1M蔗糖超速离心分离的核。核在DAPI通道中可见。 B.通过将TMEM38A抗体和磁珠与核结合而分离的亲和纯化的核。核在DAPI通道中可见。比例尺= 10微米。

数据分析

数据应根据相关下游技术的标准实践进行处理。适当的下游分析可以包括显微镜，蛋白质印迹，蛋白质组学和流式细胞仪。
来自单个小鼠腓肠肌的平均产量是1×10 6个核。将两个腓肠肌和两个股直肌集中，产生6×10 6个核和8μg总蛋白质。从胫骨前肌分离核导致核的产量非常低，这是不切实际的分析。应该注意的是，除非注意彻底清洗细胞核，否则残余的BSA可能会人为地膨胀总蛋白的测量值。为此，建议首先通过显微镜检查纯度和产量，然后测量蛋白质浓度（如果适用）。产率和纯度在实验之间是一致的。产量变化最大的原因是在实验过程中未能将样品保持在4°C。
对于蛋白质组学应用，我们取得了最大的成功，当三只小鼠的腓肠肌和股直肌都汇集起来。蛋白质组学实验应完成至少5个生物学重复，以检测蛋白质丰度的小变化。
为了通过流式细胞术进行分析，从单个腓肠肌或股直肌分离的核提供充足的起始材料。流式细胞术实验应该包括至少三个生物学重复。

笔记

肌红蛋白的生化纯化需要约5小时才能完成。如果准备大量样本，则需要更多的时间。基于磁珠亲和的制备需要约1小时才能完成。
内质网耗尽在各制剂中是可变的。

食谱

100毫克EDTA（50毫升）
合并：
372毫克EDTA
40毫升超纯水
用NaOH调节pH值至7 用超纯水调节终体积至50毫升
在室温下储存长达一年
100毫升EGTA（50毫升）
合并：
1.9克EGTA
40毫升超纯水
用NaOH调节pH值至8 用超纯水调节终体积至50毫升
在室温下储存长达一年
2.1 M蔗糖溶液（50毫升）

在高温和中等搅拌下结合以下几点： 35.9克蔗糖
2.5毫升HEPES（1M）
1.25毫升氯化钾（1M）
2.5毫升MgCl 2（100毫摩尔）
超纯水至50毫升
注意：由于溶液是通过加热，所以一些流体会沸腾。

在4°C储存长达一周
2.8 M蔗糖溶液（25毫升）

在高温和中等搅拌下结合以下几点： 24克蔗糖
1.25毫升HEPES（1M）
625微升KCl（1 M）
1.25毫升MgCl 2（100毫摩尔）
超纯水至25毫升
注意：由于溶液是通过加热，所以一些流体会沸腾。

准备新鲜的每个使用
匀浆缓冲液（50毫升）
结合以下内容：
500μlHEPES（1 M）
3毫升氯化钾（1M）
250μl亚精胺（100 mM）
750μl精胺四氢氯化物（10mM）
10毫升EDTA（10毫米）
250μlEGTA（100 mM）
2.5毫升MgCl 2（100毫摩尔）
5.13克蔗糖
超纯水至50毫升
过滤消毒，并在4°C储存长达1个月
在使用之前立即添加：
100μlDTT（1 M）
5罗氏cOmplete迷你蛋白酶抑制剂片
1％BSA均质缓冲液（50毫升）
结合以下内容：
500毫克BSA
50毫升均化缓冲液
准备新鲜的每个使用
重悬缓冲液（50毫升）
结合以下内容：
1毫升HEPES（1M）
750μlMgCl 2（100mM）
500微升氯化钾（1 M）
250μl亚精胺（100 mM）
750μl精胺四氢氯化物（10mM）
1毫升EDTA（10毫米）
45.75毫升超纯水
在4°C储存长达1个月
1％BSA重悬缓冲液（50毫升）
结合以下内容：
500毫克BSA
50毫升重悬缓冲液
准备新鲜的每个使用

致谢

这项工作得到了GKP（AR062483），AAC（AR067645）和美国国立卫生研究院的培训资金（T32GM008367）的资助。所描述的协议是从Wilkie和Schirmer（2008）的工作改编的。提交人没有报告潜在的利益冲突。

参考

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