材料和试剂

多孔玻璃凝集板（Scientific Device Laboratory，目录号：074-3032B）
组织培养板，6孔（MIDSCI，目录号：TP92006）
18针（BD，BD Biosciences，目录号：305195）
注射器，1毫升
组织培养板，12孔（MIDSCI，目录号：TP92012）
玻璃口吸管（Drummond Scientific，目录号：2-000-100）
吸气管组件，15“（Drummond Scientific，目录号：2-000-000）
组织培养板，4孔（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：176740）
塑料非组织培养培养皿（Fisher Scientific，目录号：AS4052）
雌性大鼠（8-10周龄）
慢病毒包装试剂：pRSV-Rev（Addgene，目录号：12253），pMDLg / pRRE（Addgene，目录号：12251），VSVG包膜质粒（pMD2.G，Addgene，目录号：12259）
无菌生理盐水溶液（0.9％氯化钠）
Opti-MEM培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：51985034）
Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：11668-027）
p24酶联免疫测定试剂盒（Takara Bio，Clontech，目录号：632200）
M2培养基（Millipore Sigma，目录编号：MR-015-D）
KSOM培养基（Millipore Sigma，目录号：MR-121-D）
酸性Tyrode's溶液（Sigma-Aldrich，目录号：T1788）
矿物油（Sigma-Aldrich，目录号：M8410）
4％多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：158127）
RPMI 1640（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11875093）
胎牛血清，热灭活（西格玛奥德里奇，目录号：F2442）
2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
丙酮酸钠（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11360070）
青霉素和链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）。
（可选）Clontech LentiX滴定试剂盒（Takara Bio，Clontech，目录号：631235）
生长培养基（见食谱）

设备

离心机（Beckman Coulter，型号：Optima TM L-100XP，目录号：392050）
标准倒置光学显微镜或立体显微镜
标准CO 2细胞培养箱，5％CO 2，37℃。

软件

ImageJ软件（NIH）

程序

定时妊娠大鼠的制备
1. 从06:00至20:00（14小时光照：10小时黑暗周期），将动物饲养在环境可控的设施内，并可以自由饮用食物和水。
2. 雌性大鼠（8-10周龄）与同一品系的雄性大鼠（> 3个月大）放置。
3. 确认交配是通过检查阴道灌洗来确定的。塑料移液器装有无菌盐水溶液。盐水被送到阴道。将阴道灌洗液转移到干净的多孔玻璃板上并在显微镜下观察。在阴道灌洗中存在精子被认为是妊娠日（gd）0.5。
注意：
1. 在大鼠中，阴茎塞保留不常见。因此，有必要获得阴道灌洗，而不是视觉识别精液塞。
2. 应在08：00-10：00之间进行淋洗以确认精子。如果晚些时候收集，精液可能不容易在阴道灌洗中可见，并可能导致假阴性。
病毒生产和集中
1. 293FT细胞在70-80％汇合时分成6孔板
2. 电镀16-20小时后，将培养基更换为每孔1.5ml的Opti-MEM培养基。
3. 在培养基更换后继续转染1小时
4. 在瞬时转染转导载体和第三代包装系统质粒后产生慢病毒。按照生产商的方案使用Lipofectamine 2000制备转染混合物。加入500ng转导载体（shRNA构建体或过表达构建体），200ng pRSV-Rev（Addgene质粒12253），500ng pMDLg / pRRE（Addgene质粒12251）和300ng VSVG包膜质粒（pMD2.G， Addgene质粒12259）。
5. 8小时后除去转染混合物，加入2ml补充有5％胎牛血清的Opti-MEM培养基。
6. 20小时后取出培养基并收集在储存在4℃的试管中。
  两个集合在40-48小时内执行
7. 离心培养物上清液以除去细胞碎片，过滤灭菌并通过超速离心（35,000xg克，3小时）浓缩。储存在-80°C直到用于转导。不要冻融。
8. 慢病毒载体滴度应通过酶联免疫分析法测定p24 gag抗原来确定。
胚胎收集
1. 在08：30-09：30之间收集gd 4.5怀孕大鼠的生殖道
2. 子宫从脂肪组织中分离出来，并通过在子宫 - 输卵管连接处和子宫颈处切割来切除。
3. 用子宫颈末端的M2介质冲洗尿道，用18号针头连接1ml注射器。
4. 冲洗的渗出液收集在12孔组织培养板的一个孔中。
5. 用口吸取器回收囊胚并将其转移到一滴KSOM培养基中。
6. 囊胚在CO 2培养箱中于37℃保持30分钟以稳定处理相关的压力。
注意：
1. 采集时间对于获得囊胚阶段胚胎是非常重要的。如果过早采集，胚胎将在输卵管中，冲洗子宫不会获得胚泡阶段的胚胎。如果收集太晚，胚胎开始附着在子宫上，通过冲洗子宫很难取回胚胎。
2. 应立即将胚胎转移到37℃的5％CO 2培养箱中的KSOM培养基中，不要留在未缓冲的培养基中延长期限。
3. 有关胚胎冲洗和收集的详细信息，请参阅Chiu等人，2010。
从囊胚中去除透明带
1. 在培养皿中放置两个独立的Acid Tyrode溶液液滴（约50μl液滴尺寸）
2. 在第二个培养皿中，准备5个独立的KSOM培养基液滴（大约40μl液滴大小）。
3. 在倒置显微镜下，将囊胚转移至第一个酸性Tyrode溶液液滴并监测透明带的完整性。如果透明带溶解不完全，则将囊胚移入第二滴，然后立即将它们转移至KSOM中滴。
4. 在成功去除透明带和5次KSOM洗涤之后，将囊胚转移到覆盖有矿物油的KSOM液滴中。矿物油应完全覆盖KSOM液滴，所需矿物油的总体积将取决于培养皿的大小（2-3毫升将足以覆盖KSOM液滴）。
5. 在37°C孵育胚泡进一步稳定。
注意：
1. 胚胎的存活依赖于孵育时间和暴露于酸性Tyrode溶液。过度暴露于酸性Tyrode溶液导致胚胎破裂和塌陷，这将不适合生长或体内转移实验。
2. 当胚胎转移到酸性滴定溶液时，当透明带开始离解时，必须经常观察以立即将其移除。一旦透明带被移除，胚胎应立即清洗并转移到KSOM液滴。
3. 去除透明带后，胚胎变得粘稠并倾向于聚集。
病毒孵化和洗涤
1. 如前所述（Lee等人，2009），产生含有“功能获得性”或“功能丧失”构建体的慢病毒颗粒，浓缩并保存。
2. 在30微升KSOM液滴中加入10微升浓缩的病毒。
3. 将囊胚转移到含有病毒颗粒的KSOM液滴中。液滴应覆盖矿物油（2-3毫升将足以覆盖KSOM液滴）。
4. 在37°C孵育病毒囊胚4小时。
5. 孵化后，依次用10-KSOM液滴洗囊胚。
6. 第10次洗涤后，将囊胚转移到被矿物油覆盖的KSOM液滴中，并在37℃下孵育15分钟。
注意：
1. p24外壳蛋白测量给出病毒浓度的相对评估，并不一定表明病毒批次的感染性的功效。
2. 可选的qPCR方法（Clontech LentiX滴定试剂盒）也可用于测量病毒滴度。 1 x 10 8 至3 x 10 8 感染单位/毫升可用于孵化囊胚的有效转导。
3. 500ng p24 / ml的病毒浓度对于转导是有效的。但是，有效的病毒颗粒浓度需要根据每个实验应用凭经验确定。
准备囊胚生长
1. 在4孔组织培养板的单个孔中加入750μl生长培养基（见配方）。
2. 每个孔加入一个病毒操纵的囊胚，并在37°C孵育
3. 每天观察胚泡，直到囊胚附着在4孔组织培养板上。
4. 一旦囊胚连接，删除介质，并添加新鲜的媒介。通常情况下，胚泡需要2-3天的时间来孵化和附着。
5. 在孵化的第5天，在对照囊胚中会观察到生长物（图2）。
6. 产物可以固定在4％多聚甲醛中用于免疫荧光，或者可以收获用于进一步的生物化学/分子分析。
  
  图2.氧张力和KDM3A表达对胚泡生长的影响A.示意图显示了用于囊胚的慢病毒转导和生长测定的实验计划。将囊胚用对照（Ctrl）或Kdm3a shRNA转导并培养72小时以允许来自透明带的孵化。将附着的囊胚暴露于环境（Amb）或低氧（0.5％O 2）24小时并分析。 B.代表性的从Ctrl shRNA中暴露于囊胚并暴露于Amb，Ctrl shRNA并暴露于0.5％O 2和Kdm3a shRNA并暴露于0.5％O 2的胚泡的图像。 C.通过qRT-PCR测量对照和敲低培养物中Kdm3a转录物的测量。星号表示组间差异显着（n = 6 /组; P <0.05）。 D.条形图以平方毫米显示生长区域的量化。使用ImageJ软件（Ctrl shRNA + Amb，n = 6; Ctrl shRNA + 0.5％O 2，Kdm3a shRNA1 + 0.5％O 2）测量生长的面积， n = 10; Kdm3a shRNA2 + 0.5％O 2，n = 10; * <0.05）。用C和D表示的数据用ANOVA和Student-Newman-Keuls试验进行分析。这个数字出现在 Chakraborty 等 pnas.org/content/113/46/E7212.full.pdf“target =”_ blank“>（2016）。
将病毒处理的胚泡体内转移至假孕大鼠
1. 假孕大鼠是通过将雌性大鼠交配到铁丝网底笼中的输精管结扎的雄性大鼠而制备的。通过在笼子下方的精液塞的鉴定来验证交配。在导线底部笼子下面放置黑色的纸张可以增强对精液塞的检测。
  。精囊炎的检测被认为是假孕的第0.5天
2. 在囊胚与慢病毒载体孵育4小时并随后洗涤（如上所述）之后，然后将病毒操纵的囊胚转移到3.5天假孕大鼠（〜8个囊胚/子宫角）的子宫中。
3. 怀孕可以在妊娠期和胎盘部位使用组织学和生物化学方法询问期望的时间终止（Ain et al。2006）。

数据分析

有关数据处理和分析，请参阅 Chakraborty （2016）。

食谱

生长培养基
RPMI 1640
20％胎牛血清
100μM2-巯基乙醇
1 mM丙酮酸钠
50μM青霉素和50 U / ml链霉素

致谢

该协议改编自Lee等人（2009）和Chakraborty等人。（2016）。这项工作的资金由NIH提供，HD020676和HD079363。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

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