材料和试剂

小鼠抗c-Myc（Santa Cruz，目录号：sc-40）
小鼠抗Ago2（克隆2E12-1C9）（Abnova，目录号：H00027161-M01）
兔抗GFP（Rockland，目录号：600-401-215）或鸡抗GFP（Rockland，目录号：600-901-215）
小鼠IgG1阴性对照（克隆C14）（EMD Millipore）
注意：上述抗体已经被作者测试，可能被用户需要的抗体替代。
完全蛋白酶抑制剂（不含EDTA）（Roche Diagnostics）
蛋白G Dynabeads（Life Technologies，Invitrogen TM）
RNasin（Life Technologies，Ambion ）
蛋白酶K（Roche Diagnostics）
酸性酚氯仿（Life Technologies，Ambion ）
Chloroform（Life Technologies，Ambion ）
3 M乙酸钠（pH 5.5）（Life Technologies，Ambion ）
Glycoblue（Life Technologies，Ambion ）
RNAzap（Life Technologies，Ambion ）
DEPC处理的水或不含RNase的水（Life Technologies，Ambion ）
HEPES（pH 7.4）
KCl
MaCl ₂
NP-40
DTT
EDTA
SDS
裂解缓冲液（见配方）
低盐NT2缓冲液（参见配方）
高盐NT2缓冲液（见配方）
0.5％NP-40（见配方）
蛋白酶K缓冲液（见配方）

设备

玻璃douncer
砂浆和杵
冰桶
旋转器
4℃离心机
标准蛋白质印迹设置

程序

激活和验证感兴趣的细胞中的tAGO2表达
1. 用LSL-tAgo2报告系（JAX库存号：017626）设置适当的Cre驱动系育种以在目的细胞中表达tAgo2。
2. 验证感兴趣的细胞中的tAgo2表达通过GFP标签在tAgo2内的共免疫染色和标记组织切片中的细胞类型的标记。 GFP抗体的推荐稀释度为1:800〜1:1000。
3. 安乐死鼠标，并尽快在冰上解剖感兴趣的组织
4. 在液氮中闪烁冻结组织（暂停点：组织块可以储存在液氮中至少半年）。
miRAP样品准备
注意：从本部分开始，在不含RNase的环境中工作很重要。手套应始终佩戴。台面应该用RNAzap擦拭。玻璃器皿应使用RNAzap清洁，并用DEPC处理的水或冲洗不含RNase的水。处理样品时应使用不含RNase的移液管吸头和管。所有试剂应在DEPC处理的水或不含RNase的水中制备。
1. 在含有液氮的冰桶中冷却研钵和杵。
2. 将适量的液氮倒入砂浆中（足够浸入组织块，但不要过多，以致液氮会溢出），将组织磨成细粉。
3. 将组织粉末与液氮一起转移到50ml的falcon管中，松松地盖上管，让其在室温下放置几分钟直到液氮完全蒸发。
4. 加入10倍体积的裂解缓冲液，迅速重悬浮组织粉，转移到预冷的玻璃管中
5. 均质组织悬浮液使用玻璃douncer通过douncing 50-100次。某些组织可能需要更长的时间来裂解。根据您的应用调整滴定次数。
6. 将组织匀浆转移到1.5ml或2.0ml eppendorf管中，在13,000×g离心30分钟，4℃以沉淀细胞碎片和未溶解的材料。
7. 将上清转移到新管中。这将是用于miRAP的样品。
miRNA亲和纯化
1. 根据制造商的说明制备抗体偶联的蛋白G Dynabeads。对于细胞类型特异性miRAP，使用Myc抗体;对于全组织控制，使用Ago2抗体;对于阴性对照，使用小鼠IgG1。每个样品使用的珠子的量和抗体珠子的比率应该根据经验确定。作为起点，使用10μgMyc抗体，2.5μgAgo2抗体和10μgIgG1 /50μl珠子。
2. 向IP样品中加入抗体偶联的珠子，并在4℃下，将混合物在末端旋转下孵育4小时。每个样品使用的珠的量应该根据经验确定。 Western印迹可用于检查IP的效率。如果IP后仍有上清液中残留的Ago2或tAgo2，则使用更多的珠子
3. 用低盐NT2缓冲液洗涤珠两次，用高盐NT2缓冲液洗涤两次，每次15分钟，并在55℃下用0.6mg/ml蛋白酶K处理珠20分钟。 >
4. 向样品中加入等体积的酸性酚氯仿，通过涡旋混合均匀，并在4℃以最大速度旋转15分钟;将上层相转移到新管而不干扰相间。用氯仿代替苯酚氯仿重复该萃取程序两次，以除去残余物苯酚。向转移的上层相中加入至少3体积的100％乙醇，1/10体积乙酸钠（pH 5.2）和1μl糖醇，混匀，在-80℃下沉淀RNA过夜。
5. 用75％乙醇洗涤RNA沉淀一次，并将其溶解在水中用于进一步的应用。（暂停点：RNA沉淀可以在75°C -100％乙醇中储存多年，RNA溶液可以储存在-80°C，但应避免多次冻融循环。）
从miRAP纯化的下游应用miRNA具有高质量，并且可以直接用于深度测序，miRNA Taqman PCR，miRNA微阵列，Northern印迹（其需要高输入并且可能不可能用于稀有细胞类型或低表达miRNA），遵循标准协议。
注意：建议在进行测序或微阵列之前，使用Taqman PCR快速和灵敏地检测候选miRNA。

食谱

裂解缓冲液
10mM HEPES（pH7.4） 100 mM KCl
5mM MaCl 2
0.5％NP-40
1 mM DTT
100 U ml ^-1 RNasin
Roche完全蛋白酶抑制剂无EDTA（1片/10ml）
低盐NT2缓冲液
50mM Tris-HCl（pH7.5） 150mM NaCl 1mM MgCl 2
0.5％NP-40
1 mM DTT
100 U ml ^-1 RNasin
高盐NT2缓冲液
50mM Tris-HCl（pH7.5） 600 mM NaCl
1mM MgCl 2
0.5％NP-40
1 mM DTT
100 U ml ^-1 RNasin
蛋白酶K缓冲液
100 Mm Tris-HCl（pH 7.5）
50mM NaCl 10 mM EDTA
0.5％SDS
10mg/ml蛋白酶K

致谢

该协议基于发表的论文He （2012）。

参考文献

Bartel，D.P。（2004）。 MicroRNA：基因组学，生物发生，机制和功能。 116（2）：281-297。
He，L。和Hannon，G.J。（2004）。 MicroRNA：在基因调控中发挥重要作用的小RNA。 Nat Rev Genet 5（7）：522-531。
He，M.，Liu，Y.，Wang，X.，Zhang，M. Q.，Hannon，G.J.and Huang，Z.J.（2012）。基于细胞类型的小鼠脑中microRNA谱的分析。 Neuron 73（1）：35-48