材料和试剂

13mm Nunc Thermanox盖玻片（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：150067）
24孔组织培养处理板（Corning，Costar ，产品目录号：3524）
Eppendorf Safe-Lock微量离心管（Sigma-Aldrich，目录号：T9661）
制造商：Eppendorf，目录号：022363204。
边缘剃须刀刀片（西格玛奥德里奇，目录号：Z740504）
200目网格（Sigma-Aldrich，目录号：G5151）
张单层霉菌（电子显微镜科学，目录号：70920）
乙醇BioUltra，分子生物学（西格玛奥德里奇，目录号：51976）
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水，钙，镁（Sigma-Aldrich，目录号：D8662）
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
注：为了制备4％多聚甲醛（PFA）溶液，在通风橱中在60℃下溶解4g PFA在90ml水中的溶液并滴加几滴1N NaOH（直到溶液不出现PFA沉淀物）然后取出加热，加入10毫升10×PBS，加水至100毫升，然后冷却。不要将溶液加热到70°C以上，因为PFA会在较高的温度下分解。立即使用溶液或在4°C或-20°C下保存1周。
戊二醛（Sigma-Aldrich，目录号：G7776）
淬灭溶液：在PBS中的50mM甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：410225）
一抗：兔多克隆抗LC3（Novus Biologicals，目录号：NB100-2331）
洗涤缓冲液（0.1％BSA，0.1％皂苷，在PBS中）
与金结合的二级抗体：1.4nm纳米金IgG山羊抗兔IgG（Nanoprobes，目录号：2003）
（增强剂），B（活化剂），C（引发剂）和D（缓冲剂）组成的金增强溶液（GoldEnhance TM TM EM）（Nanoprobes，目录号：2113） br />
醋酸铀酰（电子显微镜科学，目录号：22400）
注意：醋酸铀酰具有轻微的反应性并且通过摄取具有高毒性。请根据您的机构政策处理废物。
Embed-812树脂套件（电子显微镜科学，目录号：14120）
注意：
1. 这款产品已经停产，取而代之的是EMbed 812。
2. 为了更好地保存，将Embed-812（32g）与十二碳烯基琥珀酸酐（DDSA）（16g）和NMA（Nadic Methyl Anhydride）（17.4g）混合。充分混合，加入0.8克促进剂DMP30（2,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚），混合并储存于-20℃的20毫升注射器中。在使用前加热至室温。
氢氟酸（Fisher Scientific，目录号：14-650-236）
制造商：Avantor Performance Materials，J.T.贝克，目录号：9560-01。
阻塞缓冲区（见食谱）
1. 牛血清白蛋白（BSA，无IgG和无蛋白酶）（Jackson ImmunoResearch，目录号：001-000-162）
2. 正常山羊血清（Jackson ImmunoResearch，目录号：005-000-121）
3. 氯化铵（Sigma-Aldrich，目录号：A9434）
4. 皂苷（Sigma-Aldrich，目录号：47036）
5. 磷酸盐缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：P3619）
6. 氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
减少四氧化锇（见食谱）
1. 四氧化锇（OsO 4）（Electron Microscopy Science，目录号：19140）
2. 亚铁氰化钾（电子显微镜科学，目录号：20150）
3. 二甲胂酸盐缓冲液pH 7.4（来自二甲胂酸钠三水合物）（Sigma-Aldrich，目录号：C4945）
佐藤铅解决方案（见食谱）
1. 铅柠檬酸三钠（Sigma-Aldrich，目录号：15326）
2. 硝酸铅（默克，目录号：1073980100）
3. 柠檬酸三钠脱水物（Sigma-Aldrich，目录号：S4641）

设备

通风柜
60°C烤箱（Memmert，型号：UN30）
超微切片机（Leica Microsystem，型号：Leica EM UC7）
透射电子显微镜（卡尔•蔡司，型号：Leo 912AB）配备慢扫Proscan相机（ProScan）
摇摆器

程序

固定术
1. 用乙醇消毒盖玻片，用PBS洗三次，并为24孔板的每个孔容纳一个载玻片。
2. 用适当的培养基将这些载玻片铺在这些载玻片上，第二天获得60-70％的融合度。
  注：为了获得足够的技术重复，我们通常为每个条件准备6张幻灯片进行测试。在我们的研究中，我们使用表达空对照载体的原代角质形成细胞或用于HPV癌基因蛋白E6 / E7的过表达的质粒（以约1×10 5个细胞/孔接种）（Mattoscio et al。，2017）。此外，为了明确识别自噬体，应制备自噬体形成的适当的阳性和阴性对照。例如，考虑用雷帕霉素10-500nM（以增加自噬体形成）或用III类PI3K抑制剂（诸如1-10mM 3-甲基腺嘌呤或10-100nM渥曼青霉素以抑制自噬体积累）激活/抑制自噬（分别为Mizushima等人，2010）。
3. 第二天，取出培养基，用PBS洗涤2次，并在室温下将细胞在4％新鲜制备的PFA在0.1M磷酸盐缓冲液pH7.4中固定1小时。
  注意：由于戊二醛降低了蛋白质的抗原性，虽然它提供了最好的结构保存，但我们宁愿先用PFA单独固定细胞，然后在抗原标记后用戊二醛重新固定。
4. 去除PFA，用PBS清洗2次。将固定的细胞储存在4°C。
  注意：由于PFA固定是可逆的，因此长时间储存将细胞保存在储存溶液（PBS中的1％PFA）而不是单独的PBS中。
免疫标记
1. 取出固定液或储存液，每孔用PBS冲洗3次，每次5分钟，室温下用淬火液处理10分钟，淬灭主要固定剂的游离醛。
2. 通过在室温下用0.25％皂角苷，0.1％BSA的PBS溶液孵育10分钟使细胞透化。
3. 用封闭缓冲液（0.2％BSA，5％正常山羊血清，50mM NH 4 Cl，0.1％皂角苷，20mM磷酸盐缓冲液，150mM NaCl，室温下孵育细胞30分钟，参见食谱）阻止非特异性染色。
4. 去除封闭缓冲液，在封闭缓冲液中孵育盖有抗LC3一抗（1：150稀释）的盖玻片，在室温下孵育2小时。
5. 用洗涤缓冲液（0.1％BSA，0.1％皂苷的PBS溶液）洗涤细胞4次，每次5分钟。
6. 在封闭缓冲液中孵育含有与纳米金（1：200稀释）缀合的1.4nm纳米金羊山羊抗兔二抗的盖玻片1小时。
7. 用洗涤缓冲液洗3次，用PBS洗3次。
8. 用含1％戊二醛的PBS在室温下重新固定染色的细胞30分钟以保持超微结构。冲洗在PBS中，并在4°C的PBS中，直到下一步。
黄金增强
1. 在室温下平衡黄金增强溶液（A，B，C，D）的所有成分
2. 用PBS中的50mM甘氨酸洗3次5分钟。
3. 用1％BSA，0.05％Tween的PBS溶液洗3次5分钟。
4. 在PBS中冲洗3次，同时通过在Eppendorf管中加入一份各自的组分（A增强剂和B激活剂）激活金增强溶液，充分混合并孵育5分钟。
  注意：黄金增强溶液应在使用前立即准备。增加组分B的量可能有助于减少非特异性信号。
5. 加入黄金增强混合物的一部分组分C（引发剂）和D（缓冲液），分别在蒸馏水中冲洗细胞，并添加数滴的解决方案盖玻片。每盖玻片准备约40微升黄金增强解决方案。
6. 检查深紫色/黑色沉淀物的外观（图1）。黄金增强解决方案的孵化时间可能会有所不同。通常情况下，需要1到3分钟的时间才能完成开发。总是比较阴性对照（没有一抗）。
  注意：这一步骤的目标是扩大与二抗相关的金颗粒。为了改善渗透和密度标记，小尺寸的金颗粒是优选的（1.4nm）。由于这些纳米金颗粒在样品中几乎不可见，所以这一步是强制性的。但是，作为黄金的替代品，可以使用银色增强解决方案。银增强剂都是可商购的（Nanoprobes，目录号2013）或可以由单一组分制备（Stierhof等，1991）。银增强是光敏感的，可以被四氧化锇破坏，因此黄金增强溶液通常是首选的，因为它的简单使用。
7. 每次用蒸馏水洗三次，每次5分钟
  
  图1.黄金增强。在盖玻片上放一滴黄金增强溶液，并孵化，直到出现黑暗的沉淀物（肉眼可见）。较长的孵化可能会导致较暗的信号。在明亮的现场显微镜或立体显微镜下进行检查，以便对黄金开发进行精细控制。请注意，暗沉淀不会出现在阴性对照（CTRL：无一抗）。底部：在时间= 0和金增强孵育结束时（T = 3分钟）放大盖玻片。请注意，黑色沉淀只出现在第一抗体的地方。
对比度增强
1. 后处理样品与四氧化锇减少（见食谱）1小时在RT。
  在0.1M二甲胂酸钠中洗3次，每次5分钟，用蒸馏水洗三次注：使用减少锇固定步骤保留膜脂质。亚铁氰化钾的加入减少了锇，使其对膜更具反应性，提高了它们的对比度。
2. 在4℃下用1％乙酸双氧铀水溶液整体染色过夜。
  注意：不要暴露在光线下。由于铀酰和铅离子对碳水化合物和RNA中的蛋白质，核酸和羟基的高亲和力，醋酸铀酰提高了图像对比度。使用水代替酒精溶液更好地保存细胞结构是很重要的。
嵌入
1. 在升序排列的乙醇系列中，每个升序排列30％，50％，70％，80％，90％，96％的样本5分钟。最后，在100％乙醇中每次脱水3次10分钟。
2. 用乙醇包埋液1：1的无水乙醇溶液置于摇床上2小时。
3. 从乙醇树脂混合物中取出盖玻片，用纸巾吸取多余的树脂，并将盖玻片放在一滴树脂上面。 1小时后，将盖玻片移到新的树脂滴（图2A）。
  
  图2.嵌入。在树脂滴上移动盖玻片，孵育1小时（A）。将一滴Epon放在张氏模具上，盖上盖玻片（B）。
4. 用几滴树脂填充张单层模具的腔体，并在腔体的顶部放置盖玻片（确保清除盖玻片上面的多余树脂）（图2B）。
5. 在45°C烘箱中过夜，然后升温至60°C，再烘24小时。
切割
1. 要从幻灯片上分离Epon，请将Epon块从烤箱中取出，让其冷却下来。然后，在液氮中浸泡30秒，然后浸入热水中。这将从最初生长细胞的盖玻片上分离含有嵌入细胞的树脂。
  注意：或者，将盖玻片放入塑料多孔，盖上浓氢氟酸溶液（30％），摇动5-10分钟，直到玻璃完全溶解。
2. 用蒸馏水洗涤样品数次，将样品浸泡在0.1M二甲胂酸盐缓冲液中30分钟，然后用蒸馏水洗涤并干燥。
3. 使用单刃剃须刀去除树脂块的一小部分，并在空的树脂块上粘上氰基丙烯酸酯胶（图3）。
  
  图3.截面。在玻璃盖玻片被移除后，用一把剃刀刀片剪下一小块树脂块，并粘在一个空的树脂块（橡皮泥，图中的蓝色材料）的顶部。 1-2小时后，可将样品放入超薄切片机中切片。
4. 切割厚度为60-90纳米的超薄切片，并将切片收集到具有正方形或六边形开口的200目网格上。
5. 用1％醋酸铀水溶液对网格进行5分钟的染色，然后用佐藤的铅溶液（参见食谱），染色2分钟。
6. 在电子显微镜下观察并拍摄数码照片。
  注意：为了使自噬体可视化，应当以放大4,000倍的放大率（总览）至10,000倍（精细观察超微结构）观察样品，寻找LC3金颗粒阳性的双膜细胞器，并且含有未消化的细胞质内容物图4A）。

数据分析

在这个协议中，我们采用了预嵌入技术（免疫标记之前，样品嵌入树脂），以检测LC3在低丰度细胞的制备。我们最近使用这种方法在表达空载体或HPV E6 / E7癌基因蛋白的原代人角质形成细胞中对UBC9和LC3阳性自噬体进行成像（Mattoscio et al。，2017）。事实上，TEM分析显示UBC9存在于双膜细胞内结构中，我们通过LC3免疫金TEM鉴定为自噬区室，提示UBC9降解的自噬依赖性途径。＆nbsp;
尽管TEM是评估自噬过程的最佳技术之一，但自噬是一个动态过程的事实使得难以从单个超微结构快照推断有意义的数据。而且，由于与溶酶体融合发生的降解过程，一些晚期的自噬结构难以鉴定。在图4中，我们报道了人类角质形成细胞中自噬结构的形态（用箭头表示），与经典的EM制备（左）和LC3免疫标记（右）并排比较，说明了我们的策略获得的典型结果。尽管保留了关于细胞结构的详细信息（图4），并且使用抗LC3抗体标记细胞使得能够明确识别自噬，但是初始的轻度固定与单独PFA的组合和预包埋染色允许更好的抗原保存空泡。此外，直接在显微镜载玻片上固定细胞而不需要刮擦和沉淀细胞允许以相对低的细胞数工作并维持细胞超微结构。因此，我们相信这个协议可以很容易地应用于检测罕见细胞群中额外的低丰度抗原。然而，这种方法的局限性在于它不能进行共定位研究，这只能通过使用不同大小的金探针进行嵌入后EM来实现。

图4.使用TEM和LC3免疫染色的自噬体识别A.左：原代人角质形成细胞的TEM图像。右：透射电镜结合LC3免疫金标记。箭头表示自噬空泡。请注意，金颗粒（LC3）选择性富集自噬结构。 B.图4A中圈出的自噬泡的放大倍数（右）。注意膜结构，LC3阳性，并与溶酶体（较暗的身体）融合。＆nbsp;

食谱

阻塞缓冲区
0.2％牛血清白蛋白（BSA，无IgG和无蛋白酶）
5％正常山羊血清
50 mM氯化铵
0.1％皂苷
20 mM磷酸盐缓冲液
150 mM氯化钠
减少四氧化锇
1％四氧化锇（OsO 4）
1.5％亚铁氰化钾
0.1M二甲胂酸盐缓冲液pH7.4（来自二甲胂酸钠）
注意：在储存和使用过程中，避免OsO4直接暴露于光线下。 OsO4毒性很强，需要在通风橱中处理和处置。
佐藤领导的解决方案
0.21克柠檬酸铅三价铬
0.15克硝酸铅
0.15克醋酸铅三水合物
1克柠檬酸三钠脱水
混合化学物质并溶于41毫升蒸馏水中。这使得乳白色的解决方案。然后，加入9毫升4％的氢氧化钠溶液将变得清澈。过滤溶液并在室温下储存在黑色玻璃瓶中

致谢

在S.C.实验室中与这些主题相关的工作得到意大利商业协会（A.I.R.C.）（IG 2015 Id.16721）和欧盟委员会FP7-HPVAHEAD的支持。 DM是一名意大利人，每个人都是RiccíaS.Cancro（F.I.R.C.）的学者。该协议改编自Mattoscio等人，2017年，并在San Raffaele研究所显微设备“Alembic”的帮助下开发。作者宣称没有利益冲突。

参考

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