材料和试剂

用植物茎尖分生组织完成石蜡切片（Wei等人，2017）

设备

Leica DM2500光学显微镜（德国）（Leica Microsystems，型号：Leica DM2500）

软件

Windows 7操作系统（64位）
Photoshop CS6（Adobe，美国）
R（版本3.3.0）
MATLAB（ver。R2015b）
记事本++（版本7.4.2）
R和MATLAB脚本（请参阅补充文件） >

程序

首先在DM2500光学显微镜下用40倍物镜获得植物顶芽分生组织的图像，并使用默认参数作为BMP文件保存，通常图像的DPI应≥72。
然后通过Photoshop CS6打开BMP文件，并通过“图像旋转”功能进行校正，如图1所示。

图1.通过“图像旋转”矫直图片
添加一条与水平轴平行的线，使用“线条工具”（图2）添加第一个叶原基上方的部分与另一侧的相应部分。

图2.刚刚在第一片叶原基上方的一条线被添加
使用“图层”→“合并可视”功能合并线条和图片以形成合并的图片。
然后用“磁性套索工具”提取含有茎尖分生组织和直线的合并图片，该工具非常适合跟踪物体的边缘。并将它们复制到由“Control + N”（图3）直接生成的新空白图层。

图3.提取的茎尖分生组织
为了复制结果图像，新生成的图像被“图像→图像旋转→翻转画布垂直”（图4A）的命令组合翻转以产生新的垂直对称图像（图4B）。

图4.生成一个新的垂直对称图片的提取芽尖端分生组织
一个新的空白层至少可以包含两个提取的芽顶端分生组织首先由命令“Control + N”生成。然后将茎尖分生组织及其新产生的垂直对称图片放在一起（图5A），并使用函数“层”→“合并可见”合并（图5B）。
注意：在合并两幅图像之前，移动两幅图像以使两幅图像彼此靠近，直到两幅图像之间只剩下细线空间（图5B）。

图5.由提取的顶端分生组织及其垂直对称图像组成的新图像
合并后的图片通过“磁性套索工具”提取出来，并复制到由'Control + N'自动生成的新的空白图层中，使提取的图像被图像中最小的矩形（白色）所包含（图6）。

图6.图5B中显示的图片放在最小的矩形中
注意：图像边界恰好是包含组合图片的最外边界的最小矩形。
然后由“磁性套索工具”（图7A）选择合并的图像，并通过“层→新填充层→纯色”的命令组合来填充新的实心黑层（图7B）。

图7.图6中显示的图像由一个新的纯黑色图层填充
新的结果图像保存为工作目录中名为“SF”的BMP文件。这里的目录是'我：\ Biotool'。
打开“MATLAB”，并将初始目录更改为工作目录，并在工作目录下创建一个子目录，例如“脚本”（图8）。

图8.设置工作目录
把MATLAB脚本'profile.m'（补充文件）在“脚本”目录下，按如下方式在命令行上执行“配置文件”（Shi等，2015）：
（1，1，'I：\ Biotool \ SF.bmp'，'I：\ Biotool \ edge_data.csv'）
在运行该脚本之后，用户可以在存储“SF”图片边界（图9A）的平面坐标的名为“edge_data”的目录“I：\ Biotool”下获得“.csv”文件。用户也可以根据提取的边界获得图形，如图9B所示。

在此步骤中获得已经存储了图片（A）的平面坐标和基于提取的边界（B）的图形的“边缘数据”（红色矩形）
把Shi等人开发的'R'脚本（2015）根据Gielis（2003）提出的超椭圆方程，'fit.sf.R'（Shi等人，2015），'optim.sf.R'（在“脚本”目录（补充文件）。并通过Notepad ++打开“fit.sf.R”，“optim.sf.R”和“simu.sf.R”。将红色箭头指示的目录更改为您自己的目录（图10）。

图10.将“fit.sf.R”（A），“optim.sf.R”（B）和“simu.sf.R”（C）中的红色箭头指示的目录更改为您自己的目录目录
打开“R”功能，并将下面的代码粘贴到控制台中（有关这些代码的更多信息，请参见Shi等人发表的论文的附录S2（2015）（ http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fpls.2015.00856/full）：

wd <- c("I:/Biotool/Scripts/")
source (paste (wd, "simu.sf.R", sep=""))
source (paste (wd, "optim.sf.R", sep=""))
source (paste (wd, "fit.sf.R", sep=""))
source (paste (wed, "area.sf.R", sep=""))

data  <- read.csv ("I:/Biotool/edge_data.csv", header=F)
x.provi <- data [,1]
y.provi <- data[,2]

x0.val <- 200
y0.val <- 200
theta.val <- pi/4
a.val <- 50
k.val <- 0.95
n.val <- 1.90
Phi  <- seq(0, 2*pi, len=1000)
Para <- c (x0.val, y0.val, theta.val, a.val, k.val, n.val)
CV.val <- 0.01
res1  <- simu.sf(phi=Phi, par=Para, CV=CV.val, fig.opt = F)
x.simu <- res1$x
y.simu <- res1$y

x.width <- range(x.provi)[2] - range(x.provi)[1]
y.width <- range(y.provi)[2] - range(y.provi)[1]
a.ini <- max (y.width, x.width)/2
x0.ini <- (min(x.provi) + max(x.provi))/2
y0.ini <- (min(y.provi) + max(y.provi))/2
theta.ini <- pi/4
k.ini <- 0.95
n.ini <- 1.90
res2  <- optim.sf(x.provi, y.provi, x0.ini, y0.ini, theta.ini, a.ini, k.ini,
n.ini, fig.opt="F", para.list="F", convergence="Chi.square")

x0. range <- x0.ini
y0. range <- y0.ini
theta.range <- seq(0, pi/2, by=pi/8)
a.range <- a.ini
k.range <- seq(0.8, 1, by=0.1)
n.range <- seq(1.8, 2.2, by=0.1)
res3  <- fit.sf(x.provi, y.provi, x0=x0.range, y0=y0.range,
theta=theta.range, a=a.range, k=k.range, n=n.range,
para.list=F, fig.opt=F, convergence="Chi.square")
res4  <- fit.sf(x.provi, y.provi, res3$par[1], res3$par[2],
res3$par [3], res3$par [4], res3$par [5], res3$par [6],
para.list=T, fig.opt=T, convergence="Chi.square")

执行完成后，最终会生成一张名为“Data.fitting”的图片（图11）。黑色实线表示观察到的两个组合的茎尖分生组织的外轮廓;红色的实线表示预测的环。黑色虚线表示长轴的方向;蓝色的虚线表示x轴的方向。计算显示黑色虚线和蓝色虚线之间角度值的theta值并显示在R控制台中（图12）。

图11.图7A所示的预测图像

图12.预测图像的参数给定的参数包括笛卡尔系统中极点（x0，y0）的横坐标和纵坐标，长轴与x轴之间的角度θ，主半轴a，次半轴b与主半轴a的比值k，功率n，确定系数（R.square），χ2（方块）或剩余的平方和（RSS）。

数据分析

有关脚本功能的更多信息，请参见Shi等人发表的文章（2015）（ http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fpls。2015.00856 / full ）。在这里我们也提供了一个使用协议的例子来比较不同发育阶段（图13）毛竹笋和厚壁变种之间茎尖分生组织（SAM）的形态。在这个例子中，通过使用数学模型，我们发现厚壁毛竹笋的SAM形态比野生型毛竹（图13）平坦。

图13.使用此处提供的协议，厚壁Moso及其相应的野生型之间的SAM比较（Wei等人，2017）。在不同的发育阶段（S2到S6），厚壁毛（A）和野生型毛（B）竹笋尖端分生组织的形态。在不同发育阶段（从S-2到S-2），野生型Moso（C）和厚壁变异体（D）（黑色实线）的顶端分生组织轮廓和使用超椭圆方程（红色实线） 5）。每个轮廓由两个相应的根尖分生组织的半轮廓组合而成。黑色的虚线表示主轴的方向，红色的虚线表示x轴的方向。比例尺= 50微米。

致谢

本研究由中国自然科学基金（批准号：31670602,31301808）（江苏省高等学校重点学科项目资助项目）资助。该协议是根据以前的工作改编的（Shi等人，2015; Wei等人，2017）。作者声明不存在可能影响本协议设计和实施的利益冲突或利益冲突。

参考

Gielis，J。（2003）。统一各种自然和抽象形状的通用几何变换 Am J Bot 90（3）：333-338。
Shi，P.J.，Huang，J.G.，Hui，C.，Grissino-Mayer，H.D.，Tardif，J.C.，Zhai，L.H.，Wang，F.S.and Li，B.L。（2015）。使用超椭圆形来塑造针叶树几何形状的针叶树螺旋径向生长。
前植物科学 6：856
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新Phytol 214（1）：81-96。