第一部分。光学显微镜

材料和试剂

1.5-ml微型管（Ina-Optika，Bio Bik，目录号：RC-0150）
矿棉（日本岩棉，Yasaihana-block50）
剃刀刀片（羽毛安全剃刀，目录号：FAS-10）
双刃剃须刀（羽毛安全剃刀，产品目录号：FA-10）
细胞培养皿（Violamo，AS ONE，目录号：2-8590-02）
玻璃显微镜幻灯片（Matsunami玻璃，目录编号：S1214）
玻璃显微镜盖滑（奖杯，松浪玻璃，18米/平方米）
哥伦比亚生态型拟南芥
水培溶液（OAT Agrio，OAT家用肥料）
25％戊二醛（NISSHIN EM，目录号：3052）
琼脂粉（和光纯药工业，目录号：016-11875）
解决方案（请参阅食谱）
5％琼脂（见食谱）

设备

超高压汞灯（尼康公司，型号：INTENSILIGHT C-HGFI）
荧光显微镜（尼康仪器，型号：ECLIPSE 80i）
不锈钢镊子（顶部）（AS ONE，目录号：5-1076-01）
实验室玻璃瓶，螺旋盖，100毫升（SCHOTT，DWK生命科学，杜兰，目录号：21 805 24 04）
高压蒸汽灭菌器（TOMY SEIKO，型号：LSX-500）
微波炉（Nisshin EM，型号：MWF-2）
冰箱（松下，型号：NR-B52T2-H）
微切片机（DOSAKA EM，型号：DTK-Zero1）
物镜20倍（尼康仪器，型号：Plan Fluor 20x / 0.50，目录号：MRH00201）
物镜40倍（Nikon Instruments，型号：Plan Fluor 40x / 0.75，目录号：MRH00401）
物镜100倍（Nikon Instruments，型号：Plan Fluor 100x / 1.30油，目录号：MRH01902）
CCD相机（Nikon Instruments，型号：DS-Ri1）
聚光镜（尼康仪器，型号：D-CUD，D-CUO DIC）
高压灭菌器

软件

1.成像软件（Nikon Instruments，型号：NIS-Elements）

程序

叶子的生长条件和采样
1. 使用水培溶液（EC：电导率，1.2ds / m，pH7.0）使拟南芥种子（哥伦比亚生态型）萌发并在矿棉上培养。
2. 荧光灯管和由蓝色（450纳米），绿色（545纳米）和红色（660纳米）组成的白色LED用作生长的光源。
3. 将生长条件控制在22-24℃和50-70％湿度的温度下，并将生长区域上的PPFD调节至70-80μmolm -2•s -1 1/12小时光照。
4. 在12小时黑暗期之后，在光照期的1-3小时从植物收获叶
叶盘的制备
1. 将一片新鲜的叶子放在半软质材料的塑料垫上。用一把锋利的刀片切出不同尺寸的叶片块，3×5毫米的光学显微镜和1-2×3-5毫米的电子显微镜。与叶片垂直接触的剃刀刀片被小心地拉制，以免由于过度压缩而损伤细胞。
  主叶脉不应该包括在选定的叶块中（图1）注：稍大的尺寸使得光学切片更容易，而2mm或更小的尺寸使电子显微切片更容易。
2. 将切下的叶组织在室温下固定在固定溶液（参见配方）（2％戊二醛 - 磷酸盐缓冲液[pH 7.0]）至少3小时。为了方便起见，定影液中的叶子组织可以放在冰箱里过夜。
  注意：为了避免用镊子抓住组织而造成的损伤，通过附着湿镊子将叶片转移到固定溶液中（图1）。
  
  图1.用于戊二醛固定的拟南芥叶片段的制备。切除包括叶绿体的叶肉组织（A）。（B）的湿尖，并将组织带入定影液（C）。
嵌入和切片进行光镜观察
1. 将5％固体琼脂（一旦按照配方溶解和高压灭菌，将琼脂储存成固体琼脂原料，参见食谱）加热至微波沸腾，重复2-3次直至所有固体琼脂完全溶解。使琼脂溶液冷却至50-60℃，然后倒入约50mm高的塑料培养皿中。
  注意：制备与叶肉细胞具有相似硬度的琼脂块对于制作具有自然，圆形，多孔形状的组织切片是非常重要的。
2. 嵌入组织块以保持叶片横截面直立。
3. 将含有叶片的琼脂在4℃的冰箱中冷却后，切下具有嵌入的叶组织的琼脂块（图2）。
  
  图2.嵌有叶的琼脂块的制备。将融化的琼脂倒入培养皿（A）并将组织嵌入琼脂（B）中。切出琼脂块（C）切片。
4. 将块放置在微切片机的台上，并将水倒入容器中。将一半的双刃刀片安装到规定的位置，以便能够精确地将块切割成10μm的最小厚度。将一个100-μm厚的叶片挖出到载玻片上，然后进行光镜观察（图3）。
  
  图3.切片叶横断面。在微切片机（B）的载物台（A）上放置一个样品块。把一个叶子部分（C）舀到载玻片（D）上。
显微观察
1. 一滴水放在玻璃载玻片上。用不锈钢镊子的尖端舀起漂浮的组织切片并使其漂浮在载玻片上的水滴上。在样品上放置玻璃显微镜盖玻片以消除气泡（图3）。
2. 首先用20倍的物镜进行观察，从而可以从表面到叶片下侧进行整个横截面的观察。分布在每个细胞的叶绿体被视为一个整体。为了验证每个叶绿体的形状，图像被放大到40倍和100倍，聚焦于附着在细胞膜上的叶绿体。差分干涉对比（DIC）成像使得更容易检测膜结构的差异（图4）。
  
  图4.拟南芥叶绿体的光学显微镜观察叶绿体内衬植物生长期幼叶的内细胞膜（A）和花的成熟叶片（B）。拟南芥属植物在22℃的12小时光周期的受控条件下生长。对尺寸为1×2cm（A）和2×5cm（B）的叶片进行显微镜观察。比例尺代表10微米。

数据分析

从广泛的微观领域的叶绿体概述开始，观察到了各种不同的形状，这是由叶片的任一表面（反映两个表面之间的不同光照条件）的叶绿体的自然位置和方向观察叶绿体（这反映了形状的不均匀性）。为了检测叶绿体外形上的形态差异，通过集中于像内环细胞膜上附着的叶绿体（图4）进行观察分析。从膜上释放或附着在样品反面的膜上的叶绿体经常被看作缺乏类囊体结构的圆形。

笔记

叶绿体的形状，无论是否透镜，可以是类囊体结构的指标。为了观察叶绿体的透镜状轮廓，在光生长几个小时内叶子的取样是重要的。由于变形，在长时间照明期间，大的淀粉颗粒积累在叶绿体中。

食谱

修复解决方案
10毫升的25％戊二醛
115ml 50mM K-磷酸盐缓冲液，pH7.0
5％琼脂
3.5克琼脂粉
加70毫升蒸馏水

在105°C高压灭菌5分钟完全溶解琼脂轻轻搅拌，以达到均匀的液态
冷却到50-60°C使用
在室温下储存

第二部分。透射电子显微镜

材料和试剂

1.5-ml微型管（Ina-Optika，Bio Bik，目录号：RC-0150）
一次性巴斯德吸管（Fisher Scientific，目录号：13-678-30,13-678-20C）
滤纸（ADVANTEC No.1）（AS ONE，目录号：00011090）
收集废液的瓶子
试剂瓶，窄嘴，琥珀色玻璃（Spectrum Chemical，Wheaton，目录号：989-11698）
一次性塑料注射器（Terumo，产品目录号：SS-01T，SS-20ESZ，SS-50ESZ）
一次性塑料烧杯（Nisshin EM，目录号：405）
硅嵌入板（Nisshin EM，目录号：420-1）
玻璃刀用玻璃板（Nisshin EM，目录号：5402,8mm厚）
150铜电网（日新电机，维科电网）
Parafilm M（Pechiney塑料包装，AS ONE，目录号：6-711-01）
哥伦比亚生态型拟南芥
99.5％乙醇（NACALAI TESQUE，目录号：14713-53）
环氧丙烷（Nisshin EM，目录号：311）
甲苯胺蓝（Sigma-Aldrich，目录号：198161）
铅染色液（Sigma-Aldrich，目录号：203580）
戊二醛，25％安瓿瓶（Nisshin EM，目录号：3020-2）
Osmic酸溶液（Nisshin EM，目录号：3028）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（KANTO KAGAKU，目录号：32379-23）
磷酸氢二钾（KH 2 HPO 4）（KANTO KAGAKU，目录号：32378-23）
Epon 812树脂包埋试剂盒（TAAB Laboratories 500g）（Nisshin EM，目录号：342-2）
醋酸铀酰（Merck KGaA，Darmstadt（Discontinued），替代品：Polysciences，400 Valley Road Warrington，PA 18976）（Polysciences，目录号：21447-25）
分子筛3A（NACALAI TESQUE，目录号：04176-55）
2％戊二醛（见食谱）
2％锇溶液（见食谱）
0.1M磷酸钾缓冲液（pH 7.0）（见食谱）
洗涤缓冲液（见食谱）
100％乙醇（见食谱）

设备

储存瓶（样品瓶3号，10毫升）（AS一，目录号：9-851-05）
程序控制的孵化器（AS ONE，型号：ICV-450P）
超薄切片机（Leica，型号：Leica EM UC7i）
镊子（PEER-VIGOR 7型）（Nisshin EM，目录号：2246）
电炉（AS ONE，型号：HP-A1914B）
透射电子显微镜（JEOL，型号：JME-1400）
钻石刀（比尔瑞士，Diatome 2501）
玻璃刀（徕卡玻璃刀条，日清EM，目录号：542）
真空蒸发器（JEOL，型号：JEE-420T）
CCD照相机（Gatan，型号：ORIUS SC 1000，型号832TEM）
Invitro摇床（Taitec，型号：wave-S1苗条）
水净化系统（Sartorius，型号：Arium 611DI）
自动实验室搅拌机（AS ONE，型号：HM-10H）
吸气器（AS ONE，型号：AS-01）
转子（樱花，型号：VEM-16）
网格棒套件（Micro Star Corporation）

程序

注：这部分是从1965年的Desmond修改过来的。

双重固定
1. 预固定：将4-6片1-2×2-4毫米鲜叶组织放入装有0.5-1.0毫升2％戊二醛-0.1M磷酸盐缓冲溶液（参见食谱）的1.5毫升微管中1 -2小时，然后将试管置于真空干燥器中1-2小时。
2. 进行目视检查以确保叶片下沉。
3. 预固定后，用巴斯德移液管移除固定溶液并转移到废物储存瓶中。
4. 使用一个新的巴斯德吸管，1-2毫升的K - 磷酸盐清洗缓冲液（见食谱）被添加到叶片的微管。
5. 将叶子洗净10分钟，同时用手轻轻摇动管子。在摇动时，要小心防止叶子变干。该洗涤重复6次。
6. 固定后：将组织用2％四氧化锇（OsO 4）（参见食谱）在4℃下固定1小时。
脱水
1. 使用一系列含有增加浓度的乙醇（50％，60％，70％，80％，90％和95％）的溶液使组织脱水15至30分钟。
2. 随后，使用100％乙醇将组织脱水（参见食谱）60分钟，3次，同时摇动。
代换
1. 用100％环氧丙烷渗透组织两次
2. 为了逐渐增加环氧树脂的浓度，将组织浸入环氧丙烷和环氧树脂的7：3,5：5和3：7混合溶液中，每次60分钟。
3. 最后，将组织渗入纯环氧树脂60分钟。
树脂嵌入和硬化
1. 硅嵌入板填充纯环氧树脂，组织放置在树脂。
2. 在程序控制的培养箱中加热环氧树脂块注意：加热程序从35°C开始8小时，升至45°C 8小时，然后在60°C加热48小时。
光学显微镜样品的制备
1. 将环氧树脂块连接到超薄切片机上并用玻璃刀切割，以获得3μm厚的切片。
2. 使用镊子，将切片放置在放有一滴蒸馏水的载玻片上。
3. 玻片在电热板上60-70℃干燥。
4. 干燥后，将组织用1％甲苯胺蓝染色溶液染色，同时加热60秒。
5. 用水洗涤并干燥后，通过光学显微镜选择所需部分的组织样品。
修剪
将样品在立体显微镜下再次修剪至约0.5×0.5mm的超薄切片尺寸，其包括要观察的部位。
电子显微镜观察的样品的超薄切片尺寸小于光学显微镜样品的切片尺寸，切片尺寸取决于金刚石刀片的刀片宽度。光学显微镜样品的最小宽度尺寸是25mm，而电子显微镜样品的最大尺寸是3mm。因此，需要从光学显微镜样品中选择和重新修剪观察部位以用于电子显微镜。
超薄切片制备（Williams和Carter，2009）
1. 重新修剪的环氧树脂块附着在超薄切片机上，刀由玻璃刀切换成菱形。
2. 视差由于块和刀之间的平行度变化而重新调整
3. 调整好平行度之后，用金刚石刀将重新镶边的环氧树脂块切成片。
  使用超薄切片机的进料量和切割速度来调整厚度
4. 由钻石刀制成的超薄切片收集在水上。超薄部分的厚度设置为100纳米。
5. 在钻石刀船上漂浮在水面上的薄片被转移到电网上。
  
  用滤纸擦去多余的水，并将网格放入培养皿中。
电子显微镜染色
1. 超薄切片格栅附着在棒状污渍固定器的接触带上。将污渍固定器浸入装有1％乙酸铀酰溶液的离心管中10分钟。
2. 将污渍固定器放在充满蒸馏水的烧杯中。
3. 在污渍夹持器上的栅格用3次水冲洗。
4. 洗完后，用污渍纸擦干污渍。
5. 沾污持有人浸入柠檬酸铅溶液5分钟。
6. 将污渍固定器放在充满蒸馏水的烧杯中。
7. 洗完后，用污渍纸擦干污渍。
碳涂层
1. 碳涂层具有防止电子束照射在电子显微镜观察期间对超薄切片造成的损害的作用。
2. 将样品放入碳素真空蒸发器中。
3. 碳层厚度设置为20纳米。

注意：程序A-I总结在图5中。

图5.超薄切片制备和染色用剃刀将新鲜的1-2×2-4mm叶片组织切成约1mm大小，并置于1.5ml微管（A）中，，剪下环氧树脂块准备超薄切片，然后在超薄切片机（B）上切片。钻石刀的超薄部分收集在水面上。漂浮在钻石刀船的水面上的薄切片被拾取并转移到电网（C）。电子显微镜染色：将带有超薄切片网格的格栅连接到棒状污渍固定器的接触带上，然后将其浸入装有1％乙酸双氧铀溶液的离心管中10分钟，并在柠檬酸铅溶液（ d）。

透射电子显微镜观察
1. 对于电子显微镜，使用JEM 1400进行低放大倍数观察。
2. 观察数据由Gatan CCD相机和数字显微镜软件（图6）记录和存储。
  
  图6. TEM观察区分类囊体膜的精细结构。（A）和分离的成熟叶片的类囊体膜（B）的基因组类囊体膜。比例尺代表10微米。

数据分析

TEM成像数据与光学显微镜图像一致。从超过5次重复的独立实验收集的数据显示叶绿体形状和类囊体结构相似的变化。类囊体膜的结构差异显示为基纹层厚度，基质片层长度和曲率角的测量值（Nozue等人，2017）。

食谱

2％戊二醛
1毫升的25％戊二醛
11.5毫升的0.1M K-磷酸盐缓冲液
2％锇溶液
2毫升4％的锇酸溶液
2毫升0.1M K-磷酸盐缓冲液
注意：锇溶液在4°C储存在棕色瓶子中以防光。塞子用Parafilm密封。
0.1M磷酸钾缓冲液（pH7.0）
A：0.2M KH 2 PO 4（27.2g / 1000ml H 2 O）
B：0.2M K 2 HPO 4 4（45.6g / 1000ml H 2 O）
混合39毫升A和61毫升B
通过添加溶液A或B来调节pH至7.0
清洗缓冲液

用冷冻的0.1M K-磷酸盐缓冲液制备0.05M K-磷酸盐缓冲液，pH7.0
100％乙醇
将适量的分子筛放入500ml试剂瓶中，加入95％乙醇。最初混浊的乙醇溶液随时间变得清澈。使用上清液
Epon 812树脂嵌入套件
对于50毫升的Epon 812树脂：
23.2毫升的Epon 812
12.6毫升DDSA（十二碳烯基琥珀酸酐）
14.2毫升的MNA（甲基纳迪克酸酐）
为了固化树脂，加入0.75毫升DMP30（2,4,6-三（二甲基氨基甲基）苯酚）
在振动筛上轻轻搅拌Epon树脂30分钟注意：
1. 使用塑料注射器测量试剂体积并收集在塑料离心管（50ml）中。
2. 所有Epon试剂都储存在4°C。加热到室温（在温度控制条件下为22-24℃）的试剂用于树脂制备。应用条件因温度，湿度和储存条件而异。

致谢

Y Kaneko教授提供了植物样品树脂包埋方法的基础知识。我们也感谢孔多女士提供有关透射电镜分析的技术建议。我们感谢K. Fukamoto博士在准备手稿方面的协助。

参考

Desmond，H.K。（1965）。电子显微镜技术。第二版。 Blackwell Scientific Publications 。
Kutik，J。（1985）。叶片发育过程中的光合作用在：Sestak，Z. （编）。叶绿体发育。 W. Junk Publishers博士 pp：51-75。
Lichtenthaler，H.K.，Buschmann，C.，Doll，M.，Fietz，H.J.，Bach，T.，Kozel，U.，Meier，D。和Rahmsdorf，U。（1981）。高光和弱光植物的光合活性，叶绿体超微结构和叶片特性以及太阳光和树荫叶子。 Photosynth Res 2（2）：115-141。
Nozue，H.，Oono，K.，Ichikawa，Y.，Tanimura，S.，Shirai，K.，Sonoike，K.，Nozue，M。和Hayashida，N.（2017）。类囊体膜结构变异在维持生殖生长期间功能性光系统中的意义 Physiol植物 160（1）：111-123。
Oswald，O.，Martin，T.，Dominy，P.J。和Graham，I.A。（2001）。质体氧化还原状态和糖：核编码的光合基因表达的交互式调节剂 < （Proc Natl Acad Sci USA）98 /（4）：2047-2052。
Terashima，I.和Hikosaka，K。（1995）。叶和冠层光合作用的比较生态生理学。植物细胞环境 18：1111-1128。
Williams，D.B。和Carter，C.B。（2009）。透射电子显微镜：材料科学的教科书 Springer 。