材料和试剂

移液器吸头（2-200μl和100-1,000μl吸头）
1.5 ml Eppendorf管
12 x 75毫米猎鹰®5毫升无盖圆底聚苯乙烯试管（Corning，目录号：352052）
细菌样本进行分析
注意：细菌可以从多种来源（例如，液体培养物，半固体琼脂平板上的菌落，自然环境）中收获。但是，必须考虑到细胞制备步骤的适应性，这取决于细胞的具体来源。
无水乙醇（例如，Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
无菌去离子水（例如，Sigma-Aldrich，目录号：W3500）
氯化钠（NaCl）（例如，Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
氯化钾（KCl）（例如，Sigma-Aldrich，目录号：P3911）
磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（例如，Sigma-Aldrich，目录号：S9763）。
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（例如，Sigma-Aldrich，目录号：P0662）
二甲基亚砜（DMSO）（例如，Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
尼罗红染色（例如，Sigma-Aldrich，目录号：N3013）
1 N HCl和1 N NaOH溶液进行pH调节
血细胞计数器鞘液（例如，BD FACSFlow TM溶液，BD，目录号：342003）
全强度漂白剂（废物处理）
磷酸盐缓冲盐水（PBS;参见10x和1x溶液制备食谱）
透化溶液（见食谱）
尼罗河红储备液（见食谱）

设备

吸管（例如，Gilson Pipetman Classic）（Gilson，型号：P20，P200，P1000）
对于1.5ml Eppendorf管（例如Eppendorf，型号：5424，目录号：5424000010）进行离心分离。
pH计
分光光度计适用于测量在600nm（OD 600）的光密度
FACSCalibur流式细胞仪（BD，型号：FACSCALIBUR），配备有488nm波长的激发激光器和585±45nm带宽的发射滤光片。注意：如上所述，其他流式细胞仪的适用性比FACSCalibur（BD，USA）用于该测定受到适当的激发激光源和发射荧光的过滤器的可用性。 br />

软件

流式细胞仪采集软件
FlowJo [FlowJo，美国]

程序

细菌PHB染色
1. 沉淀下来 ca。 5×10 8个细菌细胞，在室温下7,500×g离心5分钟（相当于1毫升在0.5的OD 600处的大肠杆菌液体培养物）。
  注意：
  1. 注意，较低量的细胞将进行流式细胞术分析，然而，较高的初始细菌量在染色前的离心步骤期间更容易处理。
  2. 作为PHB测量的阴性对照，包括在不允许PHB积累的条件下生长的细菌群体（理想地为相同物种）（以下称为PHB-细菌）和装载有PHB的细菌群体（ PHB +细菌）没有被尼罗红染色，作为非特异性荧光的阴性对照。
  3. 离心速度和时间需要在每种情况下进行调整，以优化管底部的细菌收集，主要取决于上清液的粘度。
2. 用500μl1x PBS清洗细菌沉淀一次（见食谱），并将细胞重悬于500μl透化溶液中（见食谱）。
  室温（RT）孵育15分钟
3. 在7500×g离心5分钟收集细胞
4. 在1ml 1x PBS中重悬沉淀，用1x PBS稀释细菌悬浮液1：100至终体积为1ml（即，达到细菌浓度 > 5×10 6个细胞/毫升）。搅拌几秒钟。
5. 添加20μL的尼罗红储备液（见食谱）稀释的细菌悬液。
  涡旋混合几秒钟，在室温孵育30分钟注：请注意，正如Alves等人所述。（2017）中，为了最佳地对细菌PHB颗粒进行染色所需的尼罗红浓度在很大程度上随着物种的不同而不同（即从C. necator的0.032μM到大肠杆菌的94.2μM）。已经显示在该方案中报道的浓度在苜蓿中华根瘤菌中适当地染色PHB（Lagares Jr.等，2017）。尼罗红浓度和接触时间应该针对每种细菌进行优化。
6. 将样品转移至12×75mm 5ml Falcon试管并按照以下步骤通过流式细胞仪进行分析。
  注意：由于尼罗红荧光在加入后不久即开始衰减（Alves等，2017），所以在染色后同时测量所有样品是至关重要的。
流式细胞仪
1. 用488nm波长的氩激光设置流式细胞仪进行细胞激发，通过带宽集中在585nm的滤波器（如果使用FACScalibur流式细胞仪，在FL2通道上）获取尼罗红色荧光。寄存器正向（FSC）和侧面（SSC）散射光。如有必要，调整FSC，SSC和FL2检测器电压。将流速设置在低流量位置（例如， ca。 12μl/ sec）。
  注意：
  1. 小心遵循流式细胞仪设施使用指南（例如，预热指示，护套和废物管理）。
  2. 通常，将FSC和SSC通道电压分别设置为E02和300，将允许在FSCxSSC点图中清楚地识别细菌种群。应调整FL2通道电压以使对应于PHB + 和PHB 的中值的差值最大化> - 细菌种群（例如，在获取图1中绘制的数据期间，FL2通道电压设置为500）。
2. 用流式细胞仪分析样本和对照。每个样本记录至少100,000个事件。

数据分析

使用合适的软件（如，FlowJo [FlowJo，USA]）分析数据。已经报道了来自FL2-H的直方图的中值荧光强度（MFI;以AFU，任意荧光单位表示）与细菌PHB含量线性相关（Gorenflo等人，1999; Kacmar等人， 2006; Tyo等人，2006; Ratcliff等人，2008; Alves等人，， >，2017）。通过比较相应的MFI和作为阴性对照分析的细菌的MFI，可以鉴定每个样品中装载有PHB的细菌的群体（参见图1）。在显示表型异质性的细菌样品中，可以计算PHB <+>细胞的百分比。
至少有三个独立的样本必须作为生物样本进行处理

图1.来自苜蓿中华根瘤菌生长的样品的点样图（上图）和直方图（下图）的示例一个能够使PHB积累的氮限制和碳过量条件（右图，PHB细菌），以及来自相同样品的样品在充足氮条件下生长的细菌种类作为PHB积累的阴性对照（左图，PHB-细菌）（Lagares Jr.等人，2017）即可。 X轴表示由通道FL2登记的尼罗红（以AFU，任意荧光单位表示）的荧光估计的细胞PHB含量。每个细菌群体的中值荧光强度（MFI）值在对应的直方图插图中指示。

食谱

磷酸盐缓冲盐水（PBS）（10倍浓缩）
8克NaCl
0.2克KCl
1.44克Na 2 HPO 4 4 0.24克KH 2 PO 4 4 用1N NaOH或1N HCl将pH值调节至7.2，用水补足至100ml（通常少于1ml的1N NaOH或1N HCl储备就足够了）
在RT高压灭菌器和商店
透化溶液（乙醇中35％的PBS [体积/体积]）
350微升无水乙醇
100μl10x PBS
550μl无菌去离子水
尼罗河红股票解决方案
1毫克尼罗红
用DMSO补足1毫升
在4°C储存

致谢

这项工作得到了国家科学和技术研究委员会（CONICET），国家科学技术促进局（ANPCyT）和国立奎尔梅斯大学的支持。 A.L.得到CONICET奖学金的支持。简历。是CONICET的研究员。目前的方案改编自（Lagares Jr.等人，2017），其主要基于若干先前报道的作品（Kacmar等人，2006; Ratcliff等人，等人，2008）。作者宣称没有利益冲突。

参考

Alves，A.P.，Almeida，A.T.，Cruz，L.M.，Pedrosa，F.O.，de Souza，E.M.，Chubatsu，L.S.，Muller-Santos，M.and Valdameri，G。（2017）。使用流式细胞术在5分钟内在固氮菌中定量聚-3-羟基丁酸的简单而有效的方法。 Braz J Med Biol Res 50（1）：e5492。
Braunegg，G.，Sonnleitner，B.和Lafferty，R. M.（1978）。快速气相色谱法测定微生物生物量中的聚-β-羟基丁酸
应用微生物生物技术 6：29-37
Gorenflo，V.，Steinbuchel，A.，Marose，S.，Rieseberg，M。和Scheper，T。（1999）。通过尼罗红染色定量细菌聚羟基链烷酸应用微生物生物技术< / em> 51（6）：765-772。
Greenspan，P。和Fowler，S.D。（1985）。脂质探针的荧光光谱研究，尼罗红。 26（7）：781-789。
Jendrossek，D。和Pfeiffer，D。（2014）。聚羟基链烷酸酯颗粒（碳纳米颗粒）形成的新见解和聚（3-羟基丁酸酯）。Environ Microbiol 16（8）：2357-2373。
Kacmar，J.，Carlson，R.，Balogh，S.J。和Srienc，F。（2006）。酿酒酵母中聚-3-羟基丁酸酯的染色和定量和<使用自动化流式细胞仪检测Cupriavidus necator细胞群。 Cytometry A 69（1）：27-35。
Lagares，A.，Jr.，Ceizel Borella，G.，Linne，U.，Becker，A。和Valverde，C。（2017）。由 trans 调节<中华苜蓿中华根瘤菌>聚羟基丁酸酯的积累 / em> - 编码的小RNA MmgR。 J Bacteriol 199（8）。
Law，J.H。和Slepecky，R.A。（1961）。聚β-羟基丁酸的测定 J Bacteriol 82：33-36。
Müller，S.，Lösche，A。和Bley，T。（1993）。流式细胞仪监测细菌种群的染色程序 Acta Biotechnol 13：289-297。
Ratcliff，W.C.，Kadam，S.V。和Denison，R.F。（2008）。聚3-羟基丁酸酯（PHB）支持饥饿根瘤菌的生存和繁殖。 em> FEMS Microbiol Ecol 65（3）：391-399。
Tyo，K.E.，Zhou，H.and Stephanopoulos，G.N。（2006）。大肠杆菌中的聚-3-羟基丁酸酯的高通量筛选和Synechocystis sp。菌株PCC6803。 Appl Environ Microbiol 72（5）：3412-3417。