材料和试剂

圆形玻璃盖玻片，13毫米（VWR，Marienfeld，目录号：630-1597）
注意：高压灭菌，在室温下用40％乙醇/ 60％HCl预清洗1小时，并在RT下用Milli-Q水洗涤4次，每次15分钟。
超级玻璃滑梯（MENZEL GERHARD，产品目录号：2586E）
用于哺乳动物细胞培养的24孔培养皿（SARSTEDT，目录编号：83.1836）
塑料巴斯德吸管（SARSTEDT，目录号：86.1171）
Parafilm（Fisher Scientific，目录号：11782644）
制造商：Bemis，Parafilm，目录号：PM999。
神经母细胞瘤Neuro2a细胞（ATCC，目录号：CCL-131）
APP-RFP质粒（Szodorai等人，2009）（S.Kins，凯泽斯劳滕大学）
培养基：含有10％胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F0804）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）-GlutaMAX（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10566016））; 100U / ml青霉素 - 链霉素（10,000U / ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：15140122）
Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：11668019）
Opti-MEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：31985062）
Lipofectamine RNAiMax（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：13778150）
鼠抗APP N-末端单克隆抗体（22C11）（Merck，目录号：MAB348）
HEPES（1M）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15630080）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：10010031）
驴抗小鼠Alexa 488（Thermo Fisher Scientific，目录号：A-21202）
盖玻片安装解决方案（FluoroMount-G）（Southern Biotech，目录号：0100-01）
皂苷（Sigma-Aldrich，目录号：47036）
氯化钠（NaCl）（NZYTech，目录号：MB15901）
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
醋酸（Merck，目录号：1.00063.2511）
酸解缓冲液（见食谱）
固定解决方案（见食谱）

设备

CO 2培养箱用于原代细胞培养（BINDER，型号：CB 160）
计数室（Belden，Hirschmann，目录号：8100103）
Epifluorescence直立式显微镜Z2（Carl Zeiss，型号：Axio Imager Z2）配备了60x NA-1.4油浸物镜和AxioCam MRm CCD照相机（Carl Zeiss）

软件

ImageJ 2.0 v1.51n软件（可从 http://rsb.info.nih.gov/ij/免费下载）
GraphPad Prism 6（ https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/）

程序

注意：APP回收测定是在玻璃盖玻片上生长的Neuro2a细胞上进行的。

细胞培养和转染（第1天，第2天）
1. 在一个24孔板的每个孔的底部放置一个洗过的盖玻片
2. 在37℃下，在5％CO中，平板Neuro2a细胞（24孔板每孔30,000个细胞;调节细胞密度，使得Neuro2a细胞在再循环测定当天不会达到汇合）（见试剂）加湿培养箱（第1天）和20％O 2加湿培养箱。我们建议每个条件使用两个盖玻片。
  注意：大多数细胞会附着在玻璃盖玻片上。
3. 为了表达APP-RFP cDNA，将60-70％融合的Neuro2a细胞用0.5μgcDNA：每孔25μlOpti-MEM中的0.5μlLipofectamine 2000混合物用24孔板和250μl不含抗生素的完全培养基瞬时转染。（第二天）
4. 用完全培养基在37℃下转染2小时后更换转染培养基以避免APP-RFP（第2天）的过度表达。
5. （可选）在回收测定之前72小时（第2天），根据制造商的方案，用Lipofectamine RNAiMax（赛默飞世尔科技）进行siRNA转染用于敲低分析。
通过以下步骤（图1）（第3天）表达APP-RFP的Neuro2a细胞中的APP回收测定法（第3天）

图1.监测APP内吞，APP回收和非回收APP的方案示意图。：一种。用抗APP抗体脉冲10分钟; B.在10分钟脉冲时，在表面的非内吞的APP用酸洗剥离液除去，在20分钟追踪后，在非透化细胞中检测到表面的再循环的APP; C.经过20分钟追踪，APP的非再循环池在酸解和渗透时被检测到。
1. 用塑料巴斯德吸管移出细胞培养基，在37°C加入500μL无血清培养基，细胞培养箱孵育细胞30分钟在37°C.
  注意：所有的移液都应该缓慢地靠在井壁上，而不要接触细胞。
2. 稀释0.25μL的抗APP抗体（22C11; 0.25微克/微升股票浓度）到25μL的培养基与10毫米的HEPES（0.25μL的储备液，1M的pH 7.2-7.5）每盖玻片。
3. 将每个玻璃盖玻片上的25μl稀释的抗APP抗体滴在24孔板盖上的Parafilm上。
4. 小心地将盖玻片上的细胞面对抗体溶液，并在37°C培养10分钟细胞培养箱。覆盖反应以避免蒸发。这个步骤允许抗APP抗体结合到细胞表面APP和随后的内吞作用。
  （可选）对于表面标记控制盖玻片，小心地将盖玻片上的细胞面对抗体溶液的细胞转移，并在细胞培养箱中孵育他们在37°C 4分钟。洗涤每个盖玻片浸入PBS中37°C 4秒。将盖玻片放回到24孔板中，并在室温（RT）下加入250μl4％PFA固定溶液10分钟。用PBS（RT）洗涤3次后，进行抗APP的检测。该可选步骤允许抗APP抗体与细胞表面APP结合。
5. 洗涤每个盖玻片浸入PBS中37°C 4秒。
  （可选）为了控制内吞的APP池（参见图1A），将对照盖玻片重新放回到24孔板中并加入250μl4％PFA固定溶液10分钟以进行固定室温（RT）。用PBS（RT）洗涤3次后，进行抗APP检测。
6. 为了测定结合抗APP的再循环APP（参见图1B）的池是必要的：
  1. 通过将相应的盖玻片浸入酸性剥离缓冲液（参见食谱）中5秒钟，去除与非内吞APP相结合的表面抗APP抗体，并通过将盖玻片在37℃下在PBS中浸渍4秒小心清洗。
  2. 将盖玻片放回到含有预热的培养基（37℃）的24孔板中，在37℃在CO 2培养箱中孵育20分钟。
  3. 通过在室温下将盖玻片在PBS中浸渍4s仔细清洗细胞，然后在4％PFA中固定20分钟。用PBS清洗3次，继续检测抗APP。
7. 为了测定结合抗APP的未再循环的APP库（参见图1C），细胞在室温下在PBS中小心地洗涤4秒，接着通过将盖玻片浸入酸洗脱缓冲液中除去再循环的抗APP抗体在4％PFA中固定5分钟，在RT下20分钟。用PBS洗涤3次后进行抗APP的检测。
注意：细胞被固定20分钟而不是10分钟，因为Neuro2a细胞在检测回收的APP所需的大量操作之后倾向于与盖玻片分离。
抗APP抗体检测（第3天）。
1. 为了检测与质膜上的抗APP结合的再循环APP（20分钟追踪后，见图1B）：
  注意：因为回收的抗APP是细胞外的，所以通透不是必需的。
  1. 将Parafilm放置在24孔板盖上。
  2. 放置每个盖玻片（细胞面朝下）到50μL稀释驴抗小鼠Alexa 488（1：250）在3％FBS / PBS液滴。
  3. 覆盖反应，并在室温下孵育60分钟，在黑暗中。
  4. 将盖玻片放回到24孔板上，在室温下用PBS洗涤3次。
  5. 将盖玻片上的细胞面朝下放在显微镜载玻片上的25μlFluoromount G液滴上，让其在黑暗中过夜以保存荧光信号。
2. 为了检测结合抗APP的非再循环APP（任选的内吞对照，参见图1C）
  1. 在24孔板上放置盖玻片，加入250μl的0.1％皂角苷/ PBS在室温下透化固定的细胞20分钟。
  2. 在PBS中用PBS清洗一次
  3. 将Parafilm放置在24孔板盖上。
  4. 将每个盖玻片（细胞朝下）放入50μl的稀释的驴抗小鼠Alexa 488（1：250）在3％FBS / 0.1％皂角苷/ PBS中的液滴。
  5. 将盖玻片放回到24孔板上，在室温下用PBS洗涤3次。
  6. 将盖玻片上的细胞面朝下放在显微镜载玻片上的25μlFluoromount G液滴上，并在黑暗中干燥过夜以保存荧光信号。
  可选：在荧光标记的抗体溶液中包含DAPI（1：10,000的1mg / ml的原液）以使细胞核复染。
图像采集（第4天）
1. 图像采集可以使用epifluorescence显微镜（如ZEISS Z2）与一个60x NA 1.4油浸物镜和一个CCD相机（见设备的细节使用显微镜）。曝光时间应根据具有最明亮的预期信号的样本来确定，以尽可能多地使用摄像机的动态范围和尽可能使用16位二进制范围，而不使任何像素饱和。
2. 每个条件采集10-20个字段，以获得足够的数据进行统计分析。选择具有隔离单元格的字段以方便分析。聚焦于背侧质膜可以促进APP回收的可视化，见图2代表图像。
  
  图2.表达APP-RFP的Neuro2a细胞的APP表面标记（4分钟），内吞APP（10分钟）和再循环APP（+ 20分钟追踪）的代表性图像，抗-APP（22C11）小鼠Alexa 488（改编自Ubelmann等人，2017）。比例尺= 10微米。
图像分析与放大APP回收量化（图3）（第4天）
注意：用ImageJ / Fiji获得的单个细胞内吞的APP的荧光信号的定量

图3. APP回收的图像分析
1. 选择具有APP-RFP中值表达的细胞进行图像分析，以便使存在于表面上的APP的量均匀化，可用于内吞作用和随后的再循环。重复20-50细胞的过程，具有良好的形态学和中位APP-RFP表达，每个条件大约10个场。
2. 根据抗APP或APP-RFP信号勾画出每个细胞，使用工具“多边形选择”，使用B＆amp; C工具（不改变强度水平）增加亮度时，该信号变得可见。将其添加到“ROI经理”（shift + t）。
3. 使用原始图像中的工具“多边形选择”绘制背景投资回报率，并将其添加到“投资回报管理器”。
4. 使用ROI管理器的“度量”（单击M）度量APP-RFP和背景ROI的平均强度。使用“ROI管理器”测量APP-RFP和抗APP的两个区域（背景和细胞）的荧光强度。
5. 将所有区域转移至回收的Alexa488-抗APP通道，并使用“测量”获得每个ROI的平均荧光强度，并对每个ROI重复此程序。
6. 将度量值导出到Microsoft Excel。

数据分析

注意：数据分析是使用Microsoft Excel完成的。

每个单元格减去所有测量的背景平均荧光强度
通过APP-RFP荧光强度将Alexa488-抗APP荧光强度标准化以控制每个单细胞的APP-RFP的不同表达水平。
根据以前的研究，每个独立实验中的样品大小是每个条件约20个细胞。对于至少三个独立实验的统计学显着性是通过双尾学生t检验在正常数据（D'Agostino-Pearson综合正态性检验）上确定的，并且对于使用Tukey检验的多重比较单因素方差分析来确定GraphPad棱镜6.
非参数数据的统计显着性通过Mann-Whitney检验来检验。
数值分析和图示可以在Ubelmann等人的“2017年”中找到。

笔记

在我们的手中，APP回收是稳健的，平均结果是非常可重复的。但是，不同的细胞之间的变化预计。
最佳的APP转染依赖于必要的最佳实验条件，优质的APP-DNA质粒（最近的midi-prep）和健康的早期传代的Neuro2a细胞。

食谱

酸解缓冲液
0.5 M NaCl
0.2 M乙酸
固定解决方案
4％多聚甲醛（PFA）的PBS溶液，pH7

致谢

我们感谢S.Kins博士（凯泽斯劳滕大学）的APP-RFP质粒以及S.Miserey-Lenkei（Institut Curie）的Neuro2a细胞。这项工作得到了CEDOC和居里夫人综合补助金（334366 TrafficInAD FP7-PEOPLE-2012-CIG; Marie Curie Actions，EC）的支持，iNOVA4Health-UID / Multi / 04462/2013是一个由Fundaçãopara a Ciênciae Tecnologia（FCT）/MinêteriodaEducaçãoeCiência，通过国家基金和FEDER根据PT2020合作协议共同出资。 CGA是Investigator FCT（IF / 00998/2012，FCT）。 FU是FRM博士后奖学金获得者（SPE20130326599）和FCT博士后奖学金（SFRH / BPD / 94186/2013）。这个协议是根据我们最近在EMBO报告中发表的（Ubelmann等人，2017）。作者宣称没有利益冲突。

参考

Chaufty，J.，Sullivan，S.E。和Ho，A。（2012）。细胞内淀粉样前体蛋白分选和淀粉样蛋白β分泌受Src介导的Mint2磷酸化调节。 / J> Neurosci 32（28）：9613-9625。
Cirrito，J.R.，Kang，J.E.，Lee，J.，Stewart，F.R.，Verges，D.K.，Silverio，L.M.，Bu，G.，Mennerick，S.and Holtzman，D.M。（2008）。体内的突触活性依赖性释放淀粉样β蛋白需要胞吞作用。 Neuron 58（1）：42-51。
Grbovic，O.M.，Mathews，P.M.，Jiang，Y.，Schmidt，S.D。，Dinakar，R.，Summers-Terio，N.B.，Ceresa，B.P.，Nixon，R.A。和Cataldo，A.M。（2003） Rab5刺激的内吞途径的上调增加细胞内β切割的淀粉样前体蛋白羧基末端片段水平和Aβ产生。 J Biol Che m 278（33）：31261-31268。
Koo，E.H。和Squazzo，S.L。（1994）。证据表明β-淀粉样蛋白的产生和释放涉及内吞途径。 > J Biol Chem 269（26）：17386-17389。
Koo，E.H。，Squazzo，S.L.，Selkoe，D.J。和Koo，C.H。（1996）。贩卖细胞表面淀粉样β蛋白前体。 I.通过标记的单克隆抗体检测到的分泌，内吞和再循环。
Mucke，L。和Selkoe，D.J。（2012）。淀粉样β蛋白的神经毒性：突触和网络功能障碍 Cold Spring Harb Perspect Med 2（7）：a006338。
Rajendran，L.和Annaert，W。（2012）。阿尔茨海默病中的膜贩运途径 Traffic 13（ 6）：759-770。
Rajendran，L.，Schneider，A.，Schlechtingen，G.，Weidlich，S.，Ries，J.，Braxmeier，T.，Schwille，P.，Schulz，JB，Schroeder，C.，Simons，M.，Jennings ，G.，Knolker，HJ和Simons，K。（2008）。通过膜靶向有效抑制阿尔茨海默病β-sretase 科学 320（5875）：520-523。
Szodorai，A.，Kuan，YH，Hunzelmann，S.，Engel，U.，Sakane，A.，Sasaki，T.，Takai，Y.，Kirsch，J.，Muller，U.，Beyreuther，K.，Brady ，S.，Morfini，G。和Kins，S。（2009）。 APP顺行运输需要Rab3A GTP酶活性来组装运输囊泡。 J Neurosci 29（46）：14534-14544。
Ubelmann，F.，Burrinha，T.，Salavessa，L.，Gomes，R.，Ferreira，C.，Moreno，N.和Guimas Almeida，C.（2017）。 Bin1和CD2AP极化β淀粉样蛋白的内吞性生成 EMBO Rep 18（1）：102-122。
Yamazaki，T.，Koo，E.H。和Selkoe，D.J。（1996）。贩卖细胞表面β淀粉样蛋白前体。 II。通过免疫定位检测的内吞作用，再循环和溶酶体靶向。 J Cell Sci 109（Pt 5）：999-1008。